Presentaci

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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica
Matías Möller Lab. Fisicoquímica
Biológica Instituto de Química Biológica Facultad
de Ciencias Universidad de la República
3 de mayo de 2013
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Bibliografía recomendada Physical
Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap.
15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80,
p.122. Introduction to proteomics, Liebler,
2002.
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1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4-
Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS
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1- Generalidades
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Técnica que permite la separación y determinación
de la relación masa/carga de iones gaseosos
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Espectrometría ? Espectroscopía
(Medición de un rango)
(implica absorción o emisión de energía radiante)
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Espectrometría de masa de Biomoléculas

• Determinación de masa y/o composición
• Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares
• Polisacáridos, oligosacáridos
• Lípidos ? Lipidoma
• Fragmentos de ácidos nucleicos
• Técnica muy sensible
• puede analizar mg-ng (y menos) de material

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Espectrometría de masa de Proteínas

• Determinación de masa y/o composición
• Identificación por comparación con bases de
  datos
• (peptide mass fingerprint) y secuenciación de
  péptidos
• Modificaciones postraduccionales
• Complejos Supramoleculares
• Interacción entre proteínas
• Interacción con compuestos de bajo PM
• Plegamiento
• Niveles de expresión/modificación
  posttraduccional

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Gel 2D de hígado humano
http//ca.expasy.org/swiss-2dpage/
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cyt C 12000 Da
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Espectrometría de masa biológica
Lisozima
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Los Iones son importantes
En el proceso de Ionización se forman diferentes
tipos de iones ? cambios en m/z
MH o M-H- De la protonación o
deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles,
fosfatos, sulfatos (pueden ser M2H2, MnHn)
MNa, MK, MNH4, MCl- De la unión
de iones especialmente a moléculas que contienen
oxígeno (Na 23 Da K 39 Da)
M, M- (oxidación o reducción
monoelectrónica-no muy común)
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PM(péptido) 1162 Da
Modo positivo
Modo negativo
m 1 23 39
-1
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Espectrómetro de masa
Muestra
Entrada Volatilización/ Ionización
Analizador de masas
Detector
MALDI ESI
TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Sector
Magnético
Alto Vacío
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Cómo volatilizar una proteína?
Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI
Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI Laser
Desorption/Ionization
Sin Premio Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI
Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero
Tanaka hizo volar una proteína antes)
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Espectrómetros de masa (configuraciones para
grandes biomoléculas)
MALDI-TOF Matriz Assisted Laser
Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q
ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT
ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS
Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance
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2- MALDI-TOF
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Ionización por MALDI
(Matrix assisted Laser desorption/ionization) Las
Biomoléculas se mezclan con una matriz que
absorbe energía de un laser y al disiparla
produce la coevaporación de la muestra La
energía agregada hace que la matriz explote,
llevando la proteína cargada hacia la entrada del
analizador. El proceso de desorción está
asociado con una transferencia de H. Las
proteínas cargadas son dirigidas al analizador
mediante un campo eléctrico
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MALDI-TOF
Matriz
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MALDI
Desorción/Ionización por Laser Asistida por
Matriz
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MALDI-TOF
Se determina la masa de las moléculas cargadas de
acuerdo a su tiempo de vuelo(t). t ?
(m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan
antes al detector No tienen muy buena
resolución, pero son robustos, simples y tienen
un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)
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MALDI-TOF
Los iones positivos generados en la fuente por
MALDI son acelerados por un campo eléctrico E,
que le imparte una energía cinética Ek
zeEs donde s es la distancia de la región de la
fuente. Entonces entran a una región (tubo)
sobre la que no actúa ningún campo. los iones
con igual carga tienen la misma Ek, ½mv2
zeEs ? v (2zeEs/m)½ t D/v (m/2zeEs)½D
? m/z 2eEs(t/D)2
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MALDI-TOF
Sin E, iones a la deriva
E
-
Fig. Separación por TOF




D
s
Detector
Fuente
½mv2 zeEs ? v (2zeEs/m)½ t D/v
(m/2zeEs)½D ? m/z 2eEs(t/D)2
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Carlos Cerveñansky
25
Carlos Cerveñansky
26
MALDI-TOF
27
MALDI-TOF
Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF
28
MALDI-TOF
29
Resolución en MALDI-TOF
Carlos Cerveñansky
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Los Isótopos son importantes

• Los espectrómetros de masa diferencian entre
  isótopos
• Pesos moleculares Unidades de masa atómica
  (amu),
• se basa en una escala relativa al 126C 12 amu
• 1 amu 1 dalton 1.66054 x 10-24 g
• Abundancia isotópica
• 12C 12.0000 98.90
• 13C 13.0034 1.10

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Elemento Masa
1H 1.0078 99.985
2H 2.0141 0.015
12C 12.0000 98.90
13C 13.0034 1.10
14N 14.0031 99.634
15N 15.0001 0.366
16O 15.9949 99.762
17O 16.9991 0.038
18O 17.9992 0.200
31P 30.9738 100.00
32S 31.9721 95.02
33S 32.9715 0.75
34S 33.9679 4.21
36S 35.9671 0.02
79Br 78.9183 50.69
81Br 80.9163 49.31
Carlos Cerveñansky
32
Carlos Cerveñansky
33
Carlos Cerveñansky
34
MALDI-TOF
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3- ESI-MS
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ESI-Q
ElectroSpray Ionization - Quadrupole
Las Proteínas se introducen al analizador por un
capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado
por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte
voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas
cargadas (spray), donde el solvente termina de
evaporarse y las proteínas cargadas viajan hacia
el analizador El Analizador es un filtro de
masa cuadrupolo
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ESI
N2
38
ESI
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ESI-Q
Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama
Filtro de Masas porque normalmente transmite
iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros
iones son neutralizados y eliminados. Variando
las señales eléctricas de un cuadrupolo es
posible variar la m/z y realizar un barrido
espectral Consiste en cuatro barras cilíndricas
metálicas que sirven de electrodos del filtro de
masas Robustos, baratos y tienen tiempos de
barrido breves, no tienen muy buena resolución y
el rango de m/z llega hasta 3000
40
ESI-Q
41
ESI-Q
42
ESI-Q
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ESI-MS
Deconvolución del espectro
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
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ESI-MS
Deconvolución del espectro
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
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ESI-MS
Deconvolución del espectro
x1 (Mn)/n x2 (Mn1)/(n1) ? n
(x2-1)/(x1-x2)
n (1084.1-1) / 72.1 15 M (1156.2 x 15) -15
17328
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ESI-MS
Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo
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ESI-MS
Deconvolución del espectro
Bajo PM
Alto PM
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ESI-MS
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Comparación ESI-MS y MALDI-TOF
Cyt C
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Comparación
MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT)
Cargas/ion Pocas, en general 1 Muchas
Rango de m/z 50000 3000
Rango de masas 200.000 70.000
Interacciones no covalentes No Si
MS/MS limitado, PSD Si, CID
Acoplar LC No Si
Tolerancia a contaminantes Si No
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(No Transcript)