Presentazione di PowerPoint

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Farmaci Biotecnologici
Mariapia Vairetti Dipartimento di Medicina
Interna e Terapia Sezione di Farmacologia e
Tossicologia Cellulare e Molecolare
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Cosa sono?
1953 La scoperta del DNA
1973 - Università della Californianasce la
tecnologia del DNA ricombinante!
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Tecnica del DNA ricombinante
Tecnica del DNA ricombinante inserire un
segmento di DNA all'interno di un organismo
ospite, permettendo la combinazione di geni
provenienti da specie molto distanti tra loro
Inserimento di un gene dinteresse (es. gene
umano che codifica per la proteina da produrre
come farmaco), in un organismo ospite, fatto poi
crescere in un fermentatore industriale per
produrre la proteina
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Cosè unfarmaco biotecnologico?
Farmaco progettato mediante la tecnologiadel DNA
ricombinante.Farmaco di sintesi per cui sono
usate pratiche biotech nella fase di
progettazione o di valutazione
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Farmaci biotecnologici

• Il primo farmaco ottenuto ingegnerizzando un
  sistema vivente (batterico) è stato l'insulina,
  approvato dalla FDA nel 1982.
• Anche l'ormone della crescita umano,
  precedentemente estratto dai cadaveri, fu
  rapidamente ingegnerizzato.
• Nel 1986 la FDA approvò il primo vaccino umano,
  contro l'epatite B.

La struttura dell'Insulinarossocarbonio,
verdeossigeno bluazoto rosazolfo

• La produzione industriale di farmaci utilizzando
  i sistemi viventi come bioreattori si è da allora
  largamente diffusa, diventando attualmente la via
  preferita di sintesi di numerosi farmaci, in
  particolare per il costo di produzione
  relativamente basso.

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I medicinali biotecnologici sono più grandi e
complessi di quelli chimici
Chimici
Biotecnologici
Interferone beta peso molecolare 19.000
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Produzione

• Costi di produzione
• Costo di uno stabilimento di produzione per
  biofarmaceutici è maggiore di uno stabilimento
  tradizionale (da 200 a 400 milioni )
• Pochi siti produttivi vs i molti dei prodotti
  tradizionali
• Metodi di produzione
• Eventuale interferenza con la conformazione
  finale della molecola.
• Diverso profilo di sicurezza anche piccole
  variazioni nei processi produttivi possono
  influenzare la sicurezza e lefficacia del farmaco

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Farmaco-tossicologia Biotech

• Problemi negli studi di assorbimento,
  distribuzione, metabolismo, eliminazione
• Specie animali con sensitività simile agli umani
• Reazioni Immunologiche negli animali

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Clinica Prodotti classici

• Fase I - Studi iniziali effettuati su volontari
  sani per determinare il metabolismo e le azioni
  farmacologiche del farmaco sull'uomo, la
  sicurezza e gli effetti collaterali a diversi
  dosaggi. Questi studi possono essere compiuti
  anche su pazienti per ottenere informazioni molto
  preliminari sulla possibile efficacia della
  terapia (Fase I-II). Il numero di soggetti
  studiati non supera gli 80.
• Fase II - Studi su pazienti per esplorare
  l'efficacia del farmaco spesso attraverso il
  confronto fra un gruppo di pazienti che riceve il
  trattamento ed un gruppo di controllo che riceve
  placebo. Anche in questi studi si valutano la
  sicurezza e gli effetti collaterali. Il numero di
  soggetti studiati non supera i 300.
• Fase III - Studi su pazienti per una valutazione
  definitiva del rapporto rischi/benefici ai fini
  della registrazione del composto come farmaco. Il
  numero di soggetti studiati non supera i 3000.

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Clinica- Biotecnologici

• Esperimenti sugli animali meno predittivi
• Dose-risposta specifica non lineare, a campana,
• Studi di dose escalation più approfonditi
• Reazioni immunologiche
• es TNG 1412

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Biotech il mercato globale

• 63 Miliardi (2005)
• Vendite raddoppiate dal 2000 al 2004
• Al momento più di 190 farmaci biotecnologici sono
• sul mercato (20 del totale) e sono stati assunti
  da 325 milioni di pazienti
• Circa il 40 delle molecole in sperimentazione
• clinica sono derivanti dalle biotecnologie

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• Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici
• Le tecniche di ingegneria genetica non sono
  prive di rischi e pertanto devono essere
  utilizzate con cautela.
• Per evitare che dai risultati di queste
  manipolazioni si producano effetti indesiderati o
  imprevisti, gli esperimenti sul DNA ricombinante
  sono sottoposti a regole e a controlli molto
  severi.
• Limportanza assunta dai farmaci biotecnologici
  è comunque ormai dimostrata dal fatto che a
  livello mondiale questi prodotti rappresentano
  circa il 20 di tutti i nuovi farmaci
  convenzionali approvati ogni anno.

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• Rischi e benefici dei farmaci biotecnologici.
• Considerando che nel 2001 più di 200 proteine
  ricombinanti risultavano in fase di
  sperimentazione clinica nelluomo è prevedibile
  che nei prossimi anni i nuovi farmaci
  biotecnologici continueranno a rappresentare una
  percentuale significativa di tutti i nuovi
  farmaci che saranno immessi nel mercato.
• Pertanto la portata di questa metodica è enorme.
• La possibilità di copiare con la massima
  precisione sostanze prodotte fisiologicamente
  allarga enormemente la possibilità di intervento
  del medico. Se da una parte l'impiego del Dna
  ricombinante consente di creare nuovi farmaci,
  dall'altra può ottimizzare i farmaci già noti, ad
  esempio rendendo più facile la loro assunzione.

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Svantaggi delle biotecnologie
Sul Journal of Natural Products dove è stato
pubblicato questo studio si legge "l'avvento di
nuove tecniche di chimica combinatoria negli anni
'90 ha spinto molte industrie farmaceutiche a
cambiare metodo di ricerca". Quindi i chimici
hanno cercato la loro ispirazione per produrre
nuovi farmaci nei loro computer. Il risultato di
ciò, spiega Newman, è che ci sono sempre meno
farmaci innovativi. Nel 2004 hanno concluso tutti
i test e sono giunti in commercio solo 25 nuovi
farmaci. David Newman, direttore del
dipartimento Prodotti naturali del National
Cancer Institute americano. Dal 1981 ad oggi il
73 di tutti i nuovi farmaci messi in commercio
nascono direttamente o indirettamente (tramite
ottimizzazioni in laboratorio) da vegetali,
animali e invertebrati marini. E questo
nonostante i sempre maggiori investimenti in
campi come le biotecnologie.
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Ricerche in Biotecnologia

• La maggior parte delle ricerche sono volte alla
  produzione di proteine o peptidi per scopi
  terapeutici
• Ormoni polipetidici
• Prodotti del sangue (coagulanti e trombolitici)
• Farmaci antinfettivi e antitumorali
• Immunomodulatori e vaccini

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Prodotti Terapeutici

• La maggior parte di farmaci proteici era
  disponibile in quantità limitate
• Prodotti ottenuti per estrazione dal sangue o
  tessuti e organi delluomo o di animali con
  rischio di trasmissione di malattie infettive

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Insulina umana il primo prodotto ricombinante
autorizzato per uso terapeutico
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INSULINA
Linsulina è prodotta dalle cellule ? delle isole
pancreatiche sotto forma di un precursore di 110
aminoacidi detto preproinsulina
La conversione della proinsulina in insulina
avviene nel complesso di Golgi ad opera di
endopeptidasi.
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Effetti immediati e ritardati dellinsulina
1. Favorisce lentrata di glucosio nelle
cellule 2. Nel fegato - favorisce la sintesi di
glicogeno (utilizzo del glucosio) - inibisce la
glicogenolisi (deg. glicogeno) - inibisce la
gluconeogenesi 3. Nei muscoli - promuove la
sintesi proteica e inibisce il catabolismo
proteico - promuove la sintesi di glicogeno 4.
Nel tessuto adiposo - aumenta la sintesi di
acidi grassi e trigliceridi, riduce la lipolisi
inattivando le lipasi
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Meccanismo dazione dellInsulina
In seguito al legame con linsulina il recettore
viene subito internelizzato, in seguito ad
internelizzazione il recettore può essere
degradato o riciclato per tornare sulla
superficie della cellula. Il legame dellinsulina
al recettore porta ad una rapida
autofosforilazione dei residui di tirosina,
questo catalizza la fosforilazione di altri
substrati enzimatici. Linsulina può anche
controllare la sintesi di secondi messaggeri,
tramite lattivazione della fosfolipasi C che
possono mediare lazione di enzimi cellulari.
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Profilo fisiologico dellinsulina

• Produzione 0,6 U/kg/24h
• - produzione basale continua, indipendente dai
  pasti
• secrezione episodica e rapida, in
  corrispondenza dei pasti

20
Soggetto diabetico
15
10
Glucosio plasmatico mmol/l
Soggetto normale
5
Pasti
0
0900
1200
1500
1800
2100
2400
0300
0600
Ore della giornata
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Deficit di insulina Diabete Mellito
Si tratta della principale patologia che
interessa il pancreas endocrino. Causa
alterazioni del metabolismo ed iperglicemia
? entrata di glucosio nelle cellule
? di glucosio in circolo ? gluconeogenesi
epatica
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Diabete Mellito

• DIABETE DI TIPO I
• o INSULINO-DIPENDENTE
• Compare soprattutto nei giovani
• Insulina virtualmente assente
• Causa chetosi
• Sembra avere cause autoimmuni
• Si tratta con insulina esogena

• DIABETE DI TIPO II
• o INSULINO-INDIPENDENTE
• Compare soprattutto negli adulti obesi
• Carenza recettori insulina
• Non causa chetosi
• Sembra avere cause ereditarie
• Può essere tenuto sotto controllo con una dieta
  adeguata ed esercizio fisico
• Si tratta con antidiabetici orali (sulfaniluree)

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Analoghi dellinsulina
Sono prodotti in cui la sequenza aminoacidica
propria dellinsulina umana viene modificata ad
arte con delle sostituzioni di uno o più
aminoacidi.
Insulina Lispro
Azione rapida (lt 30 minuti)
Durata breve (3 ore)
25
Analoghi dellinsulina
Insulina Lispro
2.5
Insulina Umana Normale
Insulina Lispro
2.0
Concentrazione di insulina libera nel sangue
(µg/L)
1.5
1.0
0.5
0.0
0
240
480
Tempo (minuti)

• Somministrazione al momento del pasto (IR 30
  minuti prima)
• Somministrazione dopo il pasto nei bambini molto
  piccoli
• Minor accumulo sottocutaneo minor rotazione
  delle sedi diniezione

Poiché lazione termina dopo circa 4 ore è
necessario associarla ad uninsulina a lunga
durata, per il mantenimento dei livelli basali
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Analoghi dellinsulina
Insulina Aspart
Carica -
Azione rapida (? 60 minuti)
Durata breve (3 ore)
27
Analoghi dellinsulina
Insulina Aspart

• Concentrazione plasmatica doppia in metà tempo
  rispetto a IR
• Necessario associare uninsulina ad azione
  ritardata per il controllo della glicemia notturna

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Analoghi dellinsulina
Insulina Glargina
Asp
Cariche
Tempo di inizio (? 1.5 ore)
Lunga durata dazione (? 24 ore)
29
Analoghi dellinsulina
Insulina Glargina
4
Utilizzazione del Glucosio (mg/kg min)
2
Termine dellosservazione
0
0
20
30
10
24
Tempo (ore) dopo liniezione sottocute

• Assenza del picco dazione
• Simula il profilo di secrezione continua di
  insulina dei soggetti non diabetici
• Somministrazione 1 sola volta al giorno

Poiché formulata in soluzioni a pH acido non la
si può somministrare insieme ad altra insuline
(pH neutro)
30
Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Ormoni Polipeptidici
Peptidi o piccole proteine che svolgono funzioni
essenziali nel controllo del metabolismo nei
mammiferi. Alcuni sono farmaci salvavita
Ormone della crescita Humatrope
Eritropoietina regola la produzione di globuli
rossi da parte del midollo osseo Epocim
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Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Proteine del sangue
Proteine o fattori coinvolti nei processi della
coagulazione del sangue (fattori VII, VIII, IX)
sia nei processi che degradano i coaguli (TPA)
Si sono eliminati i rischi associati alla
potenziale contaminazione da parte di agenti
virali (HIV, HBV, HCV)
TPA Activase
Fattore VIII Recombinate
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Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Immunomodulatori e Antitumorali
I più noti sono gli interferoni che a seconda del
tipo possono esplicare attività antivirale (? e
?), immunomodulatrice (?) o antitumorale (?).
Interferone ? usato nel trattamento di cancro al
rene, melanoma, alcune forme di linfoma e
leucemie. IntronA, Infergen, Alfaferone,
Roferon-A
Interferone ? usato per ridurre lincidenza di
infezioni in pazienti con ridotte difese
immunitarie. Imukin
Interferone ? usato nel trattamento della SM,
agisce sui linfociti T inibendone la migrazione e
riduce la produzione di citochine. Avonex,
Betaferon, Rebif
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Altre categorie di farmaci prodotti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Immunomodulatori e Antitumorali
Altre molecole che trovano applicazione nella
terapia antitumorale sono le interleuchine
(IL-2), antagonisti del TNF
IL-2 usata nel trattamento di alcune forme
tumorali come il cancro al rene e alcuni
melanomi. Proleukin
Antagonisti del TNF usati nel trattamento
dellartrite reumatoide e psoriasica. Enbrel,
Remicade,
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I risultati dei farmaci biotecnologici
anticorpi nella antitumorale
Circa il 30 delle pazienti con tumore mammario,
produce un'elevata quantità di una proteina,
chiamata HER2, fondamentale per la crescita del
tumore. Contro l'HER2 è stato messo a punto un
farmaco, il trastuzumab, anticorpo monoclonale
impiegato con successo negli anni passati per
trattare il tumore mammario metastatico. Scarsi
gli effetti collaterali con l'eccezione di un
certo grado di cardiotossicità in meno del 4-5
delle pazienti trattate. L'anticorpo
monoclonale è stato utilizzato associato alla
chemioterapia, nei tumori del seno in fase
iniziale, subito dopo il trattamento chirurgico.
Il trastuzumab ha ridotto il rischio di ricaduta
del 50. La sopravvivenza libera da malattia a 4
anni nelle pazienti trattate con sola
chemioterapia è stata del 67, mentre in quelle
trattate con chemioterapia più trastuzumab è
stata dell' 85.
35
Vaccini

• I vaccini classici
• microrganismi uccisi (trattamento fisico o
  chimico)
• microrganismi vivi attenuati- tossoide-
  coniugati secondo i principi di Jenner e Pasteur
• 1995 sequenziato il genoma del primo patogeno
  (H. influenzae)

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Vaccini Ricombinanti
Mediante la tecnica del DNA ricombinante sono
stati prodotti diversi vaccini la maggior parte
dei quali è stata allestita clonando in una
cellula procariota o eucariota il gene del
microrganismo che codifica per la principale
proteina immunogena, cioè quella proteina che
nellospite porta alla produzione di anticorpi in
grande quantità.
Vaccini a sub-unità
Vaccini virali una proteina del capside o della
membrana esterna (envelope)
Vaccini batterici proteine di adesione (antigeni
delle fimbrie) o specifiche tossine modificate
(anatossine)
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Vaccino contro lEpatite B 1 Vaccino
Ricombinante Autorizzato

• Epatite B rappresenta un grosso problema
  sanitario il virus responsabile (HBV), oltre che
  a causare la cirrosi epatica è anche un agente
  cancerogeno (cancro al fegato).
• Ad oggi il numero dei portatori cronici è stimati
  sui 300 milioni e possono trasmettere il virus a
  coloro che vengano in contatto con sangue
  infetto, liquido seminale, secrezioni vaginali,
  saliva, sudore o lacrime perpetuando così il
  mantenimento dellinfezione.

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Vaccino contro lEpatite B 1 Vaccino
Ricombinante Autorizzato

• Virus a DNA con envelope
• Il virione contiene due antigeni associati al
  guscio proteico interno (core) Hbc e Hbe e un
  antigene di superficie (sullenvelope) HBsAg
  (Hepatitis B surface Antigen)

HBsAg rappresenta quindi la molecola di scelta
per allestire il vaccino.
39
Vaccino contro lEpatite B 1 Vaccino
Ricombinante Autorizzato

• Il gene virale che codifica per HBsAg è stato
  clonato in un vettore e quindi trasferito ed
  espresso in un lievito S. Cerevisiae
• Lantigene prodotto dal lievito presenta tutte le
  caratteristiche della proteina HBsAg nativa
  (glicosilazione e altre modifiche
  post-traduzionali)
• Antigene viene purificato per ultracentrifugazione
  , cromatografia e precipitazioni frazionate
  (purezza gt 98) viene adsorbito su Al(OH)3 che
  funziona da adiuvante

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Vaccino contro la Meningite Batterica

• Il maggior responsabile di questa patologia è il
  batterio Haemophilus Influenzae di tipo b (Hib).
• Prima della diffusione del vaccino la Meningite
  Batterica colpiva negli Stati Uniti 1 bambino su
  200
• 1/4 dei bambini che sopravvivevano allinfezione
  presentavano lesioni cerebrali o perdita
  delludito

Oggi, grazie al vaccino ricombinante la meningite
da Hib è una rarità lincidenza di infezione si
è ridotta del 90 ed in alcuni paesi è
addirittura scomparsa
Hiberix
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Produzione di tossine batteriche modificate, da
parte dello stesso ceppo patogeno, dopo mutazione
genetica
Vaccino Antipertosse

• Mediante la tecnica del DNA ricombinante è stato
  ottenuto un ceppo di Bordetella Pertussis capace
  di produrre una tossina della pertosse del tutto
  identica, antigenicamente, a quella del ceppo
  patogeno, ma assolutamente priva di tossicità.
• La tossina mutata, prodotta in laboratorio su
  larga scala, viene purificata e impiegata come
  vaccino

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Vaccini vivi ricombinanti
Batteri o virus modificati geneticamente in modo
da poter essere impiegati come vaccini vivi
ricombinanti
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Vaccini vivi ricombinanti
Microrganismi eterologhi naturalmente non
patogeni o resi tali

• Alcuni proxivirus e batteri del genere Salmonella
  ed Escherichia
• Dopo ingegnerizzazione fungono da vettori di geni
  esogeni, esprimono cioè le proteine immunogene
  dellagente patogeno verso cui si vuole
  proteggere lindividuo

• Nuovi vaccini si sono incorporati i geni di
  alcuni virus (Epatite B, H. Simplex, Influenza
  Virus) nel genoma del Vaccinia Virus
• Nel coniglio, esperimenti preliminari di
  vaccinazione hanno dimostrato che si ottiene
  protezione valida verso questi virus
• La scelta di questo virus vettore sta nella sua
  resistenza un vaccino così allestito non deve
  essere refrigerato e può venire liofilizzato e
  somministrato mediante scarificazione cutanea

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Vaccini vivi ricombinanti
Ceppi di microrganismi patogeni omologhi

• In questi microrganismi sono stati modificati o
  deleti i geni che ne condizionano la virulenza
• Il microrganismo potrà moltiplicarsi nel soggetto
  vaccinato, stimolando attivamente la risposta
  immunitaria specifica senza però causare la
  malattia
• Virus Erpetico allo studio quale vaccino dopo
  delezione del gene TK che causa la virulenza
• Batterio Vibrio Cholerae allo studio quale
  vaccino dopo averlo privato della capacità di
  produrre lenterotossina attiva, ma ancora in
  grado di indurre immunità

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Dove è concentrata la ricerca biotech nel mondo
Source PLG Italy Convegno Novara 12-12-06
Intervento G. Corsico - modificata