Fibrosi Cistica I

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Fibrosi Cistica I
Lezione 7
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Cose la Fibrosi cistica
q2 1/2500 ?q1/50 ?p1-q49/50 ? ?
2pq2x49/50x1/50 1/25

• LA CF E SOGGETTA AD EFFETTO DEL FONDATORE
• (e presente in molte razze, ma e piu frequente
  nella popolazione del Nord-Europa)

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Eredita autosomica recessiva

• GENITORI PORTATORI HANNO IL 25 DI PROBABILITA
  DI AVERE UN FIGLIO AFFETTO E INDIVIDUI SANI CON
  UN FRATELLO O SORELLA AFFETTO HANNO 2/3 DI
  PROBABILITA DI ESSERE PORTATORI.

• I portatori di CF sono molto frequenti anche per
  effetto del VANTAGGIO DELLETEROZIGOTE gli
  eterozigoti hanno un vantaggio riproduttivo
  rispetto agli omozigoti (potrebbe essere dovuto
  al fatto che sono maggiormente resistenti alla
  salmonella tiphi, un batterio che richiede Cl per
  crescere e riprodursi e la CF e causata da un
  difetto del canale del Cl).

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Fibrosi Cistica un po di storia

• 1985 Analisi di linkage il gene della fibrosi
  cistica (CF) viene associato ad un polimorfismo
  proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora
  la localizzazione.

• Perche non si hanno informazioni sulla natura
  del
• prodotto del gene si sa solo che da qualche
  parte
• del genoma ce un locus la cui sequenza, quando
  mutata, provoca la Fibrosi cistica. Si applica il
  clonaggio posizionale

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Ripuntualizziamo la definizione di gene

• il gene mendeliano e un entita astratta
  identificata dalla modalita di segregazione e
  dalla mappatura in un locus

• il gene molecolare e una sequenza codificante
  con una organizzazione definita 5UTR,
  esoni,introni, 3UTR .... corrispondente ad una
  sequenza amminoacidica o piugenericamente ad un
  trascritto

• il locus e una regione genomica la cui
  espressione porta ad un fenotipo per cui e piu
  giusto parlare di locus-malattia che di
  gene-malattia. Il locus puo essere piu grande
  del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus,
  non fra geni molecolari

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Come fare il linkage

• Testando tutte le famiglie in cui e presente
  almeno un affetto con
• polimorfismi del DNA di cui si conosce la
  localizzazione. Quando si
• trova il linkage ho mappato fisicamente il locus

• Ho trovato il gene?!

• NO!!!

Non ho trovato il gene corrispondente al mio
carattere adesso so dove andarlo a cercare
Torniamo a Mendel
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2a legge di Mendel
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Risultati possibili

• Rapporto fenotipico diverso dovuto alla
  formazione di 4 tipi di gameti che si originano
  tutti con la stessa probabilita e diano tutte le
  possibili combinazioni

RY 1/4 Ry 1/4 ry 1/4 rY 1/4
RY 1/4 RRYY 1/16 RRYy 1/16 RrYy 1/16 RrYY 1/16
Ry 1/4 RRYy 1/16 RRyy 1/16 Rryy 1/16 RrYy 1/16
ry 1/4 RrYy 1/16 Rryy 1/16 rryy 1/16 rrYy 1/16
rY 1/4 RrYY 1/16 RrYy 1/16 rrYy 1/16 rrYY 1/16
Gameti
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Rapporto mendeliano nellassortimento indipendente
X
P
A1/A1B1/B1
A2/A2B2/B2
F1
A1/A2B1/B2
Meiosi
4 tipi di gameti in rapporti uguali
A1 B1
A1 B2
A2 B1
A2 B2
A1 B1
X
gamete A1/A1 B1/B1
1A1B1
1A1B2
1A2B1
1A2B2
F2
10
Rapporto genotipico nellassociazione completa
meiosi
2 tipi di gameti in rapporti uguali
gamete A2B2
X
F2
A1/A2B1/B2
A2/A2B2/B2
11
Rapporto genotipico nella associazione parziale
P
X
A2/A2B2/B2
A1/A1B1/B1
A1/A2B1/B2
F1
4 tipi di gameti in rapporti non uguali
80 parentali
20 ricombinanti
gamete A1B1
X
F2



4 A1/A1B1/B1
4 A1/A2B1/B2
1 A1/A1B1/B2
1 A1/A2B1/B1
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Ricordiamo lincrocio a 3 punti
A B C
1 2
a b c
tutti i possibili gameti
A B C
A B c
crossing over 2
parentali
a b c
a b C
A b c
crossing over 1
A b C
crossing over 12
a B C
a B c

• Ma questo incrocio ha laplotipo noto!

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Ancora terminologia

• Aplotipo genotipo del gamete. Se prendo in
  considerazione 3 locus ognuno
• presente nella popolazione con 2 alleli i
  genotipi possibili nei gameti sono
• A1,B1,C1 A2,B1,C1 A1,B2,C2 A1,B1,C2 ETC.... a
  priori non so chi sta
• con chi. Nelle popolazioni naturali solo
  lanalisi della progenie mi dice quale era
• laplotipo dei parentali e solo nei grandi
  numeri. Le cose si complicano
• ulteriormente quando non disponendo di fenotipi
  codominanti come i polimorfismi
• posso seguire i loci solo con caratteri soggetti
  alla dominanza e recessivita.

• In alternativa al termine aplotipo si usa spesso
  il termine fase

Ricordate fase cis e trans? Accoppiamento e
repulsione? Sono sinonimi di aplotipo sopratutto
quando si parla di locus corrispondenti
a caratteri dominanti e recessivi
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Probabilita di trovare ricombinanti
SE I LOCI NON SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA E
1/2 X 1/2 X 1/2 X1/2 1/160.0625
SE I LOCI SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA DIPENDE
DA QUANTO SONO DISTANTI
SE LA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE E 10
RICOMBINANTE
LA P DI 3 NR E 1R 0.1X0.9X0.9X0.90.0737.3
NON RICOMBINANTI
Non ho la possibilita di scegliere fra le due
ipotesi solo un gran numero di osservazioni mi
potrebbe permettere di riconoscere quale e la
situazione piu probabile NON ESISTE NULLA CHE
POSSA SOSTITUIRE I GRANDI NUMERI.COME POSSIAMO
OTTENERE GRANDI NUMERI NELLUOMO???
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Linkagefase

• ATTENZIONE ALLA RICOSTRUZIONE DELLA FASE

• Fase combinazione degli alleli di una regione
  che deriva da ciascun genitore. Se la fase non e
  nota bisogna sommare il lod score che si
  ottengono ipotizzando le possibili fasi.

• Meiosi informative sono quelle che danno
  informazioni sulla ricombinazione.

a1a1 a2a2
a1a2 a1a2
a1a2 a1a2
a1a2 a3a4
a1a2 a1a2 a1a1
a1a4
non infor.
non infor.
infor.
infor.
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Linkagefase di piu locus

• Definizione della regione candidata con analisi
  di linkage ricostruzione degli aplotipi
  studiando la segregazione nelle famiglie. E
  necessario risalire alla fase e identificare i
  ricombinanti

Ricomb
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
2 2 1 9 5 5
7 4 4 2 5 4
2 5 2 6 2 2
1 4 1 3 7 5
7 5 4 6 6 2
A B C D E F
A B C D E F
6 5 2 6 2 2
A B C D E F
6 5 2 6 2 2
A B C D E F
6 5 2 6 2 2
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
10 4 6 4 1 6
10 3 2 3 5 8
5 3 5 3 1 7
8 3 8 4 2 3
10 3 2 3 5 8
2 2 1 9 5 5
3 6 5 5 7 8
2 2 1 9 5 8
8 6 3 2 1 8
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F

• Possedere un particolare polimorfismo
• non vuol dire avere la malattia, lo studio di
• linkage e a livello di popolazione, serve ad
• individuare una regione non la mutazione
• patologica(tutti hanno il locus alcuni hanno
  lallele mutato in patologico)

A B C D E F
6 5 2 6 2 2
A B C D E F
8 6 3 2 1 8
A B C D E F
6 5 2 6 2 2
2 2 1 6 2 2
7 4 4 2 5 4
3 6 5 5 7 8
6 5 2 6 2 2
A B C D E F
A B C D E F
7 5 4 6 6 2
A B C D E F
A B C D E F
A B C D E F
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Linkage possibili inconvenienti

• Ci possono essere inconvenienti che complicano
  la possibilita di assegnare un locus malattia a
  una regione definita da marcatori

• Errori umani errata lettura dei dati, scambio
  di campioni, paternita

• Errori diagnostici un falso ricombinante.Se i
  marcatori sono molti e vicini
• la presenza di un doppio ricombinante fa
  sospettare un errore

• Eterogeneita genetica famiglie con fenotipo
  simile vengono accorpate e non si riesce a
  trovare il linkage. Sclerosi tuberosa due loci
  distinti
• Nelle recessive il problema e la necessita di
  utilizzare solo le famiglie piccole.

• E importante disporre di numerosi siti
  polimorfici

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I polimorfismi

• Oggi si dispone di una serie di nuovi
• polimorfismi del DNA che permettono
• di aumentare linformativita degli incroci

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Polimorfismo RFLP esempio
Lunghezza dei frammenti
Alleli identificati dallibridazione su Southern
I1 I2
I3 I4
II1
II2
III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8
Possibile interpretazione dei risultati
I
1 2 3 4
II
1 2
III
1 2 3 4 5 6 7 8
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RFLP e Paternita
A B C D E F G
F e la madre di G A, B, C, D,E sono indiziati
di stupro chi e il padre del bambino? E
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due individui, tre enzimi
BBamHI E EcoRI HHindIII
H E B
BE H B
10KB
13KB
3.7KB
2.8
Evidentemente ce un sito B polimorfico perche
un soggetto e omozigote per 2.8 e laltro per
13. La lunghezza dei frammenti mi permette di
costruire una mappa di restrizione e di mappare
la sonda rispetto ai siti. La differente
quantita di DNA fra i due campioni e evidente
dalle diverse dimensioni del segnale
Filtro corrispondente
Gel
E quindi presente un polimorfismo, probabilmente
frequente nella popolazione infatti se prendendo
due individui a caso nella popolazione trovo due
omozigoti eprobabile che gli eterozigoti siano
frequenti. Per gli altri due siti non si puo
dire se siano polimorfici o no due individui
sono troppo pochi per escluderlo.
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Polimorfismo PCR

• Mini e micro satelliti Riconosciuti su gel dopo
  amplificazione con PCR

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SSCP Single Strand Conformational Polymorphism
A
C
C
G
G
T
A
A
C
G
T
T
A
C
C
G
T
G
A
A
C
T
G
T
G
T
A
VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA
DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL
C
Omo WT
Omo mut
etero
Questo test si utilizza per identificare la
variazione di una base senza dover ricorrere al
sequenziamento. Si possono identificare il
70-95 delle mutazioni di singola base in
frammenti di lunghezza inferiore alle 200pb.
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SNPs
La sostituzione di una base puo provocare la
perdita o linsorgenza di un sito di
restrizione, utilizzando PCR e digestione
dellamplificato si puo rapidamente evidenziare
lavvenuto cambiamento senza utilizzare il
southern, il radioattivo etc..
Gene qualunque non e importante chi e e il
concetto che conta
1241bp
Lallele XT e XC sono distinguibili dopo
digestione con TaqI. Lamplificato e di 1241 bp
dopo digestione se e presente la sostituzione si
hanno 2 bande
750bp
491bp
XCXC XCXT XCXC XCXC
25
SNPs
Gene qualunque non e importante chi e e il
concetto che conta
Lallele XT e XG sono distinguibili dopo
digestione con PvuII. Lamplificato e di 1392
bp dopo digestione se e presente la sostituzione
si hanno 2 bande 1163 e 229
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12
1392bp
1163bp
La banda di 229 non si vede
1, 2, 4, 7, 8 sono eterozigoti XTXG
3,9, 12 sono omozigoti XTXT
5,6,10, 11 sono omozigoti XGXG
26
SNPs
Gene qualunque non e importante chi e e il
concetto che conta
Lallele YT e YC sono distinguibili dopo
digestione con HgaI. YT non si digerisce e
rimane di 220 bp, YC origina due bande 180bp e
40bp (che non si vede)
C0 1 2 3 4 5 6 7
220bp
180bp
C0 controllo senza DNA il bianco e importante
nella PCR come il marker
3 omozigote YTYT - 1, 4, 6, 7, omozigoti YCYC -
2, 5 eterozigoti YC YT
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Gli STS Sequence Target Site
Lautomazione del sequenziamento permette di
sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a
caso da cui ricavare primers per screenare con
la PCR ormai automatizzata le librerie e
costruire mappe fisiche attraverso la creazione
di contigui . Quando sono polimorfiche sono
marcatori comuni alle mappe sia genetiche che
fisiche e permettono di legarle fra loro
STS A,B,C..
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Come fare il linkage

• Il calcolo del linkage e quindi statistico
• occorre una progenie numerosa
• e
• bisogna conoscere la fase (aplotipo)
• dei parentali.

• come si fa visto che le famiglie umane
• sono di solito piccole?

Si ricorre al lod score
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Linkage-lod score

• Il linkage e una relazione di vicinanza fra due
  loci ed e funzione della loro
• distanza. La definizione di un linkage fra due
  loci si basa su calcoli statistici
• che permettono di quantizzare la probabilta che
  i risultati ottenuti non siano
• dovuti al caso . Nel caso delluomo lanalisi
  della progenie di una singola famiglia
• raramente fornisce informazioni sia per lo scarso
  numero di meiosi sia per la
• difficolta di risalire alla fase. Bisogna
  mettere insieme i dati provenienti da
• piu famiglie.

(1-???n ?r
P di un assortimento genetico in una progenie se
i geni sono associati
Odds ratio
(1/2)nr
P di un assortimento genetico nella progenie se i
geni sono indipendenti
Lod score logaritmo in base 10 dei singoli
rapporti di ogni famiglia, si possono
cosi sommare. Un valore di 3 indica linkage.