Presentazione di PowerPoint

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Analisi di proteine
Elettroforesi e Western Blot
Seminario Metodologico per il Corso di Didattica
Libera
Marilena Dinardo mm.dinardo_at_biologia.uniba.it
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• Le proteine sono il prodotto dei geni sono le
  proteine che servono a fabbricare un organismo,
  a farlo funzionare e, quando sono difettose, si
  rendono responsabili di malattie.
• Ed è proprio attraverso lo studio del
  funzionamento delle proteine che si potrebbe
  arrivare alla costruzione di nuovi farmaci.

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Purificazione delle proteine

• La purificazione di una proteina costituisce il
  primo passaggio nello studio delle sue proprietà.
• Una proteina, per poter essere purificata, deve
  dapprima essere estratta dalla sua matrice
  biologica e poi allontanata selettivamente dalle
  altre proteine.

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• La procedura adottata per ottenere un estratto
  grezzo (estratto contenente tutte le proteine
  cellulari solubili nel tampone di estrazione
  utilizzato) dipende dalla localizzazione
  cellulare della proteina di interesse.

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La rottura delle cellule può essere ottenuta
mediante

• Digestione enzimatica della parete o della
  membrana plasmatica mediante appropriate miscele
  di cellulasi, lipasi e proteasi (tripsina,
  collagenasi, ialuronidasi)
• Shock osmotico
• Successivi cicli di congelamento/scongelamento
• Generalmente devono però essere applicati metodi
  più energici, che sottopongono le cellule a
  stress meccanici. I metodi di rottura meccanici
  sono fondamentalmente di due tipi
• mediante forze frizionali tra cellule e materiale
  solido
• mediante forze frizionali in sospensione di
  cellule.

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• Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di
  vetro e da un pestello mosso a mano (Dounce o
  Tenbrock) o elettronicamente (Potter-Elvejham).
• Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello
  viene fatto ruotare per generare le forze
  frizionali, le quali sono più elevate alla
  superficie del pestello e minime lungo la parete
  del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la
  parete del tubo è mantenuta entro dimensioni
  precise in quanto lattrito sviluppato dipende
  dal raggio del pestello e del tubo di vetro e
  dalla velocità di rotazione del pestello stesso.

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• Le procedure utilizzate per ottenere un estratto
  proteico grezzo sono estremamente semplici e
  richiedono
• - la rottura delle cellule in uno specifico
  buffer
• - la centrifugazione del campione per rimuovere i
  residui insolubili.

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Campioni proteici

• Estratti di tessuti o cellule
• Proteine ricombinanti etichettate con antigeni
  (tags HA, T7)
• Virus interi purificati
• Localizzazione cellulare (nucleo, membrana,
  citoplasma)

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Estrazione delle proteine

• Lisi delle cellule con un tampone di lisi che
  dissocia le proteine e inibisce le proteasi
  cellulari
• Concentrazione dei sali
• Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS)
• pH
• Inibitori di proteasi
• Bassa temperatura (ghiaccio)

Proteasi
Proteasi
Inibitori proteasi Leupeptina, Pepstatina,
Aprotinina, PMSF
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Elettroforesi
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• Analisi elettroforetica delle proteine del siero

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La velocità di una molecola carica che si muove
in un campo elettrico è direttamente
proporzionale alla forza del campo elettrico (E)
e alla carica della molecola (q) ed è
inversamente proporzionale alle dimensioni della
molecola e alla viscosità del mezzo in cui si
muove (forze frizionali fo resistenza) v
Eq/f dove f6pr?
Elettroforesi
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Fattori che influenzano la velocità di
migrazione

• CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma)
• TAMPONE (Concentrazione, pH)
• SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

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SUPPORTI

• Non setaccianti
• (Carta), acetato di cellulosa
• Setaccianti
• Gel di poliacrilammide(PAG)
• Gel di Agarosio

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Elettroforesi su gel

• Metodo per separare le molecole (DNA, RNA,
  proteine, etc.) sulla base di proprieta fisiche
  o chimiche quali
• (1) dimensioni
• (2) forma
• (3) carica elettrica

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Elettroforesi di DNA

• I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide
• I campioni di DNA vengono caricati ed e
  applicata una differenza di potenziale
• Il DNA, carico negativamente, migra verso
  lelettrodo
• I frammenti di DNA piu piccoli migrano piu
  velocemente

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Elettroforesi di Proteine

• Piu complessa dellelettroforesi di DNA
• Proteine diverse hanno cariche diverse
• Le proteine variano molto per forma
• Generalmente il gel e fatto di poliacrilammide

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Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare
le proteine?

• I gel di poliacrilammide hanno una trama piu
  compatta
• I pori hanno dimensioni minori che nei gel di
  agarosio
• Le proteine sono molto piu piccole del DNA
• Amminoacido medio 110 Da
• Paio di nucleotidi medio 649 Da
• 1 kilobase di DNA 650 kDa
• 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi 36
  kDa

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Elettroforesi di proteineCondizioni Non
Denaturanti

• Non-denaturante (nativo) nessun pre-trattamento
  delle proteine prima dellelettroforesi
• Le proteine conservano la loro forma normale
  (struttura 2 e 3 legami disolfuro covalenti)
• Le proteine conservano la loro carica normale
• Le proteine sono separate sulla base di carica,
  dimensioni e forma

Nome Carica Massa Forma
Proteina Q
Proteina R
3
30kD
?4
42kD
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Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti

• Le proteine sono trattate con SDS (detergente
  anionico) prima dell elettroforesi (SDS-PAGE)
• Le molecole di SDS si legano alle proteine
• Le proteine perdono la loro normale forma
• Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto
  carica/massa
• Le proteine vengono separate esclusivamente sulla
  base delle loro dimensioni

Carica Massa 3 30kD ?4 42kD
Carica Massa ?300 30kD ?420 42kD
SDS
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(No Transcript)
22
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

• SDS (Sodio Dodecil Solfato)
• Solubilizza e denatura le proteine
• Aggiunge cariche negative alle proteine

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Proteina Nativa Carica netta -4
Proteina trattata con SDS Carica netta Molto (-)
24
Sistemi per la corsa di SDS-PAGE
Amersham Biosciences
Bio-Rad
Medio (16 x 16 cm)
Piccolo (8 x 10 cm)
25
(No Transcript)
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Come funziona un Gel SDS-PAGE ?

• Le proteine cariche negativamente si muovono
  verso lelettrodo positivo
• Proteine piu piccole si muovono piu velocemente
• Le proteine si separano per dimensione

SDS, calore
s-s
Proteine con SDS
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Cosa ce nelbuffer di caricamento?

• Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8)
• SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le
  proteine e fornire loro una carica negativa
  complessiva
• Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli
  scendere nei pozzetti
• Un agente riducente (DTT o b-Mercaptoetanolo) per
  rompere i legami disolfuro
• Un colorante (Blu di Bromofenolo) per
  visualizzare i campioni

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Il Gel

• E costituito da due parti
• Stacking gel 4-5 gel superiore, pH 6.8
• Running gel 8-14 gel separatore, pH 8.8
• Le molecole di acrilammide sono tenute assieme
  dalla bis-acrilammide, formando una struttura a
  lattice
• Polimerizzazione piu rapida aggiungendo
  catalizzatori TEMED e APS

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Il Gel

• Componenti del gel SDS-PAGE
• Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide
• Tris-HCl pH 6.8 oppure Tris-HCl pH 8.8
• SDS
• ddH2O
• TEMED
• APS (ammonio persolfato)
• Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)

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Il Gel

• Come funziona
• Proteine vengono caricate, viene applicata una
  corrente elettrica
• Includere un marker di peso molecolare colorato
• 10-50ug di estratto proteico totale
• 0.1-1ug di proteina purificata
• Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina ()
• Si muovono verso il gel separatore (resolving)
• Differenze di pH causano la ionizzazione della
  glicina, permettendo alle proteine di migrare nel
  gel separatore

Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8

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Il Gel

• di acrilammide consigliata
• 8
• 10
• 12

• Dimensioni delle proteine
• 40-200 kDa
• 21-100 kDa
• 10-40 kDa

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Visualizzazione delle proteine nel gel I due
metodi piu usati sono Colorazione con il
Coomassie Brilliant Colorazione con largento
Silver staining (puo essere visualizzato 1ng
di proteina per banda)
Coomassie staining
Silver staining
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Stima dei pesi molecolari
250
200
150
Dimensioni in kDa
100
50
0
0
20
40
60
Distanza (mm dal pozzetto)
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Stima dei pesi molecolari
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Western Blotting
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Southern Blot Per lanalisi del DNA. (sonda
DNA o RNA). Northern Blot Per lanalisi dell
RNA. (sonda DNA o RNA). Western Blot Per
lanalisi delle proteine. (sonda anticorpo).
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Cosa e un Western Blot?

• Una tecnica in cui le proteine sono separate
  mediante elettroforesi su gel e successivamente
  trasferite su un supporto (membrana o filtro).
  Successivamente una specifica proteina viene
  identificata mediante la sua reazione specifica
  con un anticorpo.

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A cosa serve il Western Blot?

• Qual e la proteina che mi interessa?
• SDS-PAGE (non certo)
• Si basa sul confronto di peso molecolare
• Western blot (certo)
• Si basa su una reazione specifica
  antigene-anticorpo

?
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Fasi di un Western Blot

• Prima fase elettroforesi su gel.
• (Le proteine del campione vengono separate su un
  gel in base alle loro dimensioni)
• Seconda fase trasferimento su membrana.
• (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una
  membrana di nitrocellulosa mediante un campo
  elettrico)
• Terza fase saturazione o blocking.
• (La saturazione e usata per prevenire le
  interazioni non specifiche tra lanticorpo e la
  membrana)

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Fasi di un Western Blot

• Quarta fase legame dellanticorpo primario.
• (Lanticorpo riconosce la proteina specifica
  immobilizzata sulla membrana)
• Quinta fase legame dellanticorpo secondario.
• (Lanticorpo secondario, coniugato a un enzima
  (AP o HRP), riconosce specificamente lanticorpo
  primario, gia legato alla proteina sulla
  membrana)
• Sesta fase rivelazione o detection.
• (Lenzima coniugato allanticorpo secondario
  scinde un substrato che, in corrispondenza della
  proteina specifica, sviluppa precipitato colorato
  o chemioluminescenza)

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Western blot seconda faseImmobilizzazione e
trasferimento

• Le proteine nel gel sono ancora in soluzione
• Le bande diffondono e si confondono col tempo
• E necessaria limmobilizzazione per
• Preservare in maniera permanente lesperimento di
  elettroforesi
• Permettere il riconoscimento di proteine
  specifiche
• La strategia piu comune e il trasferimento su
  membrana
• Nitrocellulosa
• PVDF (Polivinilidene fluoride)
• Nylon

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Western blot seconda faseImmobilizzazione e
trasferimento
membrana
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Western blot seconda faseImmobilizzazione e
trasferimento

• Elettroblotting
• Apparato di trasferimento
• Il gel e messo tra strati di carta da filtro con
  la membrana a diretto contatto col gel sul lato
  verso lelettrodo positivo
• Viene applicato un campo elettrico e le proteine
  migrano fuori dal gel verso lelettrodo positivo
  e si legano alla membrana
• Fatto a 4C per evitare surriscaldamento,
  decomposizione del tampone e degradazione delle
  proteine

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Western blot seconda faseImmobilizzazione e
trasferimento

• Trasferimento dal catodo (-) all anodo ()
• Spugnette
• 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di
  trasferimento
• Gel
• Membrana
• 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di
  trasferimento
• Spugnette

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Apparato per il trasferimento Semi-dry
46
(No Transcript)
47
Western blot seconda faseImmobilizzazione e
trasferimento

• Componenti del tampone di trasferimento
• 25mM Tris
• 190mM glicina
• 20 metanolo

48
(No Transcript)
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Western blot terza fasesaturazione o blocking

• Per saturare i siti idrofobici liberi sulla
  membrana
• Per prevenire il legame dellanticorpo primario
  alla membrana stessa
• Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)

50
(No Transcript)
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Western blot quarta faseincubazione con
anticorpo primario

• Lanticorpo primario riconosce la proteina di
  interesse e non lega le altre proteine
  immobilizzate sulla membrana
• Anticorpi come sonde
• Molto sensibili
• Possono essere prodotti
• Immunizzando una specie diversa (anticorpi
  policlonali)
• Generando anticorpi monoclonali (mAb)
• Economici

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Anticorpi
Ab Ag AbAg
Kd
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Anticorpi

• Anticorpi (immunoglobuline, Ig)
• Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in
  risposta ad uno specifico antigene, come un
  batterio o un virus, che neutralizza lantigene
  legandosi specificamente ed esso e producendo una
  risposta immunitaria.

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Anticorpi policlonali

• Produzione
• Immunizzazione ripetuta dellanimale con
  lantigene (peptide, proteina purificata o
  ricombinante)
• Il sangue e prelevato nel momento di picco di
  produzione dellanticorpo ed e purificato il
  siero
• Il pool degli anticorpi riconosce molti epitopi
  dellantigene usato per limmunizzazione

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Anticorpi monoclonali

• Riconoscono solo un epitopo

56
Western blot quarta faseincubazione con
anticorpo primario
57
(No Transcript)
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Western blot quinta faseIncubazione con
anticorpo secondario
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Anticorpi

• Anticorpo primario
• Riconosce la proteina

• Anticorpo secondario
• Lega lanticorpo primario
• Generalmente prodotto in una specie diversa
• Coniugato con un enzima
• Il substrato dellenzima sara convertito in un
  prodotto colorato
• Puo anche essere radioattivo o fluorescente

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Western blot quinta faseIncubazione con
anticorpo secondario
61
(No Transcript)
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Western blot sesta faserivelazione o detection

• Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano
  (HRP horseradish peroxidase)
• Conversione di un substrato colorimetrico in un
  precipitato colorato
• Substrati Chemioluminescenti
• Emettono luce se convertiti dallenzima
• Possono essere visualizzati su lastre
  radiografiche
• Marcatura radioattiva
• Anticorpi secondari biotinilati

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(No Transcript)
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A cosa serve il Western Blot?

• Quanta proteina di interesse ce?

Proteina di interesse
Bande non specifiche
Proteina, pg