ENZYMOLOGIE

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ENZYMOLOGIE

• -Principe général
• Spécificité de l'association protéine - ligand
  -Contrôle de l'activité enzymatique
• FLEXIBILITÉ CONFORMATIONNELLE DES PROTÉINES
• Interactions protéine-ligand
• Enzymes Allostériques
• Interactions Protéines-Ligands

Pr Miloud SLIMANI Département de Biologie Faculté
des Sciences Université de Saida (Algérie)
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Principe général Comme pour toute protéine, un
mécanisme enzymatique commence par la fixation
dun substrat (ligand) par des liaisons faibles
entre les fonctions portées par celui-ci et des
restes daminoacides ou des cofacteurs , une zone
particulière de lenzyme dite site de fixation A
ce site, le substrat est transformé en produit,
puis celui-ci est libéré. Le site de fixation du
substrat est dit site actif.
Ligand Corps chimique ayant une liaison
spécifique avec une enzyme .
Site actif
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Il existe quatre types denzymes possibles _
Protéine enzymatique seule. _ Apoenzyme
coenzyme. _ Apoenzyme ion. _ Apoenzyme
coenzyme ion.
Apoenzyme Coenzyme Holoenzyme
Le terme holoenzyme est l'assemblage
du cofacteur (qui peut être un ion métallique, ou
une molécule organique) et d'une ou
plusieurs chaînes protéiques, formant ainsi
une enzyme complète et active. L'holoenzyme est
donc le complexe enzymatique catalytiquement
activé par ses cofacteurs. La partie protéique de
l'enzyme est alors nommée apoenzyme et la partie
non protéique coenzyme . Lorsque la partie non
protéique est un ion métallique (oligo-élément) ,
le complexe est alors nommé métalloprotéine.
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Co-facteurs Corps chimique intervenant dans une
réaction enzymatique - pour transporter ou
compléter un substrat - pour accepter un
produit - comme participant à la structure de
lenzyme. Plusieurs enzymes ont besoin de
co-facteurs pour agir. Co facteur métallique
être des ions (Fe2, Mg2, Zn2 de lanhydrase
carbonique., etc) qui sont indispensable à
lactivité enzymatique _ Soit parce quil est
responsable de la stabilité de la structure
tertiaire de lapoenzyme. _ Soit parce quil
intervient dans la fixation du substrat. _ Soit
parce quil participe directement à la
catalyse.
Enzyme Anydrase carbonique , la présence dune
atome de Zn est indispensable à son activité
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Certains cofacteurs sont des molécules plus
complexes synthétisées par les cellules
coenzymes.
Les coenzymes sont des molécules organiques qui
sont cofacteurs de certaines protéines enzymatique
s avec lesquelles ils forment souvent
un complexe stable. La protéine seule est
appelée apoenzyme, associée à son ou à ses
coenzymes, on parle d'holoenzyme. En général,
seule l'holoenzyme est catalytiquement
fonctionnelle. Les coenzymes sont en général
impliqués directement dans la catalyse, par
exemple au travers de réactions de transfert
d'électron, de proton, de groupements
fonctionnels ou encore sont impliqués dans le
transport du substrat entre sites actifs. Il y a
deux familles de coenzymes - ceux qui ne sont
que transitoirement liés à lenzyme et que lon
considère alors comme des co-substrats, - ceux
que lon nomme groupes prosthétiques et qui sont
liés de façon covalente à la protéine.
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Cofacteurs
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Spécificité de l'association protéine - ligand
- Notion de site actif Toutes les
protéines (sauf les protéines intrinsèquement non
structurées) se replient dans une conformation
dite native et c'est dans cette conformation
qu'elles acquièrent leur activité
biologique (leur pouvoir de catalyseur dans le
cas des enzymes). Ce repliement aboutit à une
structure tridimensionnelle fonctionnelle unique
de la protéine. -Cette structure globale de la
macromolécule permet à une région
particulière, le site actif  (souvent enfoui au
sein de la protéine), d'adopter elle aussi une
structure spatiale qui est reconnue par le ligand
spécifique de la protéine  Le site actif dune
enzyme est la région tridimentionnelle qui se lie
au substrat , une petite zone privilégiée de la
protéine enzymatique dont la géométrie a une
importance considérable sur la spécificité, il
est situé dans une zone hydrophobe dans la partie
interne de la structure. Il assure deux fonctions

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-fixation du substrat ( site de fixation , de
reconnaissance) est constitué de certains Acides
aminés qui sont associés avec lorientation du
substrat , et donc, avec la spécificité de
lenzyme ,responsable de la stéréospécificité. -t
ransformation du substrat ( site catalytique )
est constitué des résidus qui sont directement
impliqués dans la formation et rupture des liens
chimiques. Ces résidus sont souvent localisés
dans le fond de la cavité, et dans la majorité
des cas, possèdent des chaînes latérales ioniques
ou réactives (ex. His, Lys, Cys, Ser, Asp, Glu).
-Les autres AA sont qualifiés d'auxiliaires, de
collaborateurs ou de non collaborateurs selon
leur degrés d'intervention dans l'acte catalytique
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La stéréochimie qui résulte de cet agencement
unique des acides aminés qui constituent le site
actif est la cause de la stéréospécificité de
reconnaissance  entre ces acides aminés et le (ou
les) ligand(s).
Le substrat induit un changement conformationnel
du site actif de l'enzyme. Les orbitales des
groupements catalytiques et du groupement
réactionnel du substrat sont alignées de manière
optimale pour l'acte catalytique .
Substrat (S) est la molécule qui entre dans une
réaction pour y être transformée grâce à laction
catalytique dune enzyme. Produit (P) la
nouvelle molécule qui apparaît au cours dune
réaction catalysée par une enzyme est appelée
produit.
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LIAISONS ET INTERACTIONS DES PROTÉINES Toutes les
protéines assument leurs fonctions biologiques au
moyen de liaisons ou dinteractions
stéréospécifiques avec des ligands très divers
électrons, ions, molécules organiques ou bio
-polymères. Ainsi, dans une cellule, toute
molécule a été liée au récepteur qui lui a permis
dy pénétrer ou à lenzyme qui la produite et
toute molécule sera liée au transporteur qui la
dirigera vers sa destination ou à lenzyme qui la
transformera. Des protéines sassocient
étroitement entre elles pour former de larges
complexes dont la masse moléculaire peut
atteindre des millions de daltons certaines
sunissent à des polysaccharides ou à des lipides
pour participer à lédification des membranes
dautres entrent en interaction avec le DNA pour
contrôler sa réplication et son expression ou
avec des RNA pour réguler la biosynthèse des
protéines elles-mêmes. Certains complexes entre
protéines sont permanents, et cest le cas des
protéines multimériques ou des complexes
multienzymatiques dautres sont transitoires,
et cest le cas des enzymes liés à leur
inhibiteur protéique, ou des anticorps fixés à
leur antigène protéique.
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Interactions protéine-ligand
ES
EP
E S
La liaison se réalise grâce aux forces entre
molécules, telles que les liaisons ioniques, les
liaisons d'hydrogène et les forces van der Waals.
Généralement, l'interaction est réversible et
plus ou moins forte suivant le nombre et la
nature des liaisons formées. La force de cette
interaction est définie par la constante de
dissociation .La liaison d'un ligand à une
protéine réceptrice modifie souvent la
conformation de cette dernière. L'énergie
associée aux interactions intermoléculaires
formées entre la protéine et son ligand permet de
promouvoir ce changement de conformation, appelé
ajustement induit. Cette modification structurale
peut ainsi moduler éventuellement son état
fonctionnel et son activité.
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Deux modèles pour expliquer la spécificité des
enzymes La complémentarité stérique entre
lenzyme et son substrat est a lorigine de cette
spécificité et que les enzymes et les substrats
se reconnaissent comme une clé sadapte dans une
serrure
Forme induite lenzyme change sa conformation
lors de la liaison du substrat Ajustement induit
dynamique -lors de la fixation de
substrat, lenzyme change de conformation
Suppose que lenzyme a une structure flexible
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FLEXIBILITÉ CONFORMATIONNELLE DES PROTÉINES Les
protéines, comme toutes les autres macromolécules
biologiques, ne sont pas rigides. Leur structure
fluctue autour de son état déquilibre et adopte
de nombreuses conformations dont certaines sont
même susceptibles daffecter la forme globale de
la molécule. Ces fluctuations jouent un rôle
important dans les propriétés fonctionnelles des
protéines. Elles leur confèrent la possibilité de
sadapter à un changement de milieu environnant
ou de fixer des ligands dune manière optimale,
pour la catalyse par exemple .De plus, des
changements conformationnels importants
permettant la transition dun état à un autre
sont nécessaires pour réguler lactivité, par
exemple le passage dun état inactif à un état
actif ou dun état de faible affinité à un état
de forte affinité. Ainsi, dans le cas des
protéines allostériques, lactivité biologique
est contrôlée par des mouvements globaux faisant
suite aux interactions des substrats eux-mêmes ou
de leurs produits, ou encore à la fixation
deffecteurs
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Changement conformationnel et flexibilité Lhexoki
nase catalyse la réaction glucose ATP
glucose-6-P Cest une étape clé du métabolisme
des glucides La fixation de glucose entraîne une
modification conformationnelle indispensable à la
mise en oeuvre de la catalyse
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Modulabilité Lactivité dune enzyme est
contrôlée par des modulateurs Les activateurs
augmentent lactivité. Les inhibiteurs la
diminuent. Cette modularité permet dajuster la
vitesse globale dun métabolisme au besoin
cellulaire Exemple La phosphofructokinase est
activée par lAMP et inhibée par lATP. Cette
modulation active ou inhibe la glycolyse selon
que la charge énergétique est faible ou élevée.
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• ENZYMES ALLOSTERIQUES
• 1-Définition
• Le terme allostérique vient du grec allos, autre,
  et stereos, forme.
• Les enzymes allostériques ont une structure
  quaternaire ,ce sont des protéines complexes
  composée de plusieurs sous-unités. Souvent leurs
  sous unités sont disposées de manière à ce que la
  molécule ait un axe de symétrie. Chaque sous
  unité peut fixer une molécule de substrat. Il
  existe au moins un site de fixation pour le
  substrat (site actif, catalytique) et au moins un
  site de fixation (spécifique) pour un modulateur
  (site régulateur).
• Les enzymes allostériques prennent une autre
  conformation à la suite de la liaison du
  modulateur

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2-Propriétés des enzymes allostériques 
Cinétique des E allostériques - Vitesse en
fonction de S
Les enzymes allostériques se distinguent des
autres enzymes (michaeliens) par leur courbe
vf(S) qui nest pas une hyperbole correspond à
léquation Michaelis Menten , mais une courbe
sigmoide . Une cinétique sigmoïde reflète en
général des interactions coopératives entre
plusieurs sous unités protéiques .
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Cette propriété de coopérativité des protomères
donne un avantage aux systèmes allostériques par
rapport aux enzymes à cinétique michaelienne pour
la régulation de la vitesse des réactions
enzymatiques
Effet de coopérativité la coopérativité traduit
le fait que la fixation sur l'enzyme d'une
molécule d'un effecteur allostérique influe sur
la fixation des molécules suivantes. Dans le cas
de coopérativité en présence du substrat -Si
l'effecteur allostérique est le substrat lui même
on parle de modulation homotrope - Si
l'effecteur est différent du substrat on parle de
modulation hétérotrope -Dans une coopérativité
positive, une molécule d'un effecteur entraîne
l'augmentation de l'affinité pour les mêmes
molécules et vice versa pour une coopérativité
négative
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Formalisme de Hill
L'équation de Hill concerne le cas particulier de
la fixation d'un même ligand sur plusieurs sites
d'une protéine oligomérique possédant un site de
fixation sur chaque monomère.
Léquation exprime le degré de saturation dune
protéine oligomérique en fonction de la
concentration en ligand

? la fraction des sites comportant un ligand
lié, L est la concentration de ligand et Kd est
la constante de dissociation apparente. La
constante n s'appelle la constante de Hill ,
décrit le degré de coopérativité de la fixation
du ligand
n  paramètre qui dépend du degré de
coopérativité entre les sites de liaison du
ligand en interaction la constante de Hill (n)
augmente avec le degré de coopérativité dune
réaction
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• Si n1,léquation est celle dune hyperbole  la
  réaction de liaison de ligand est dite non
  coopérative. L'équation de Hill se réduit alors à
  une fixation simple, comme dans l'équation de
  Michaelis-Menten.
• Si ngt1 est à coopérativité positive  la liaison
  du ligand augmente laffinité de E pour les
  liaisons du ligand ultérieures .La coopérativité
  se traduit par une courbe de saturation de forme
  sigmoïde, d'autant plus marquée que la
  coopérativité est forte
• Si n lt 1, la réaction est dite à coopérativité
  négative  la liaison du ligand diminue
  laffinité de E pour les liaisons ultérieures du
  ligand la fixation est anticoopérative.
• Plus le nombre de Hill, n, est grand et plus la
  coopérativité est forte. En général, n est
  inférieur au nombre de sites, c'est-à-dire au
  nombre de sous-unités de la protéine.

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Modélisation La transition concertée de Monod,
Wyman et Changeux (MWC) . - Enzyme
allostérique oligomères (plusieurs
sous-unités) - Chaque protomère (sous-unité) ne
contient quun seul site pour un ligand -Les
sous-unités (protomères) sont équivalentes afin
que chaque oligomère possède au moins un axe de
symétrie. -selon la théorie de l'allostérie
chaque sous unité catalytique peut exister sous
deux états conformationnels R ou T  -une forme
T tendu (tense) à faible faible affinité pour le
substrat ou sous forme R relâché ( relased ) à
forte affinité pour le substrat . - Ces états
sont en équilibre et ceci indépendamment de la
liaison dun ligand à loligomère - Deux
sous-unités de différentes conformations ne
peuvent pas sassocier
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(No Transcript)
23
Modèle symétrique Lorsque lénergie interne dun
protomère augmente par suite de la modification
de ces liaisons, on dit quil passe à un état
tendu. Au contraire lorsque les dites liaisons
lui imposent une structure correspondant à une
énergie interne diminuée, on dit quil passe à un
état relâché
c'est la fixation du ligand qui modifie
l'équilibre entre les formes R et T. En présence
du substrat , léquilibre est déplacé vers R  Un
effecteur activateur favorisera le maintien de la
forme R de l'enzyme. En labsence du substrat ,
léquilibre est en faveur de T Un effecteur
inhibiteur favorisera le maintien de la forme T
de l'enzyme
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Modulations allostériques de types K et V  Les
enzymes allostériques peuvent être distingués
selon les effets exercés sur elles par les
effecteurs homotropes et hétérotropes qui
les concernent. Ainsi, on distingue 1-Les
enzymes du système K (K est le symbole de la
constante d'affinité ) où l'effecteur ne modifie
que l'affinité apparente (K 1/2 équivalent Km)
de l'enzyme pour le substrat.
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(No Transcript)
26
2- Les enzymes du système V où l'effecteur ne
modifie que la vitesse maximale (Vmax) de la
réaction.
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Action des effecteurs allostériques
Activateurs allostériques Activateur
allostérique déplace léquilibre T -----R vers
R  laffinité de lenzyme pour le substrat est
augmenté, la K0.5 est diminué , La courbe vf(S)
est déplacée vers la gauche inhibiteurs
allostériques Un inhibiteur allostérique déplace
léquilibre T---R vers T  laffinité de lenzyme
pour le substrat est diminué , la K0.5 est
augmentée, la courbe vf(S) est déplacée vers la
droite .Linhibition allostérique est un
phénomène hétérotrope négatif
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Importance des enzymes allostériques Ont un rôle
de régulation très important dans la cellule En
général lenzyme allostérique catalyse la 1ère
réaction, limitante dune voie métabolique .Son
activité peut être contrôlée par des activateurs
ou inhibiteurs appartenant à cette voie
métabolique permettent ladaptation du
métabolisme au besoin de la cellule.
A le substrat de E1 enzyme clé, allostérique, est
un modulateur positif ( activateur allostérique,
il active lenzyme) et X, le produit final est un
modulateur négatif ( inhibiteur allostérique, il
inhibe lenzyme). En effet ,dans certains
systèmes multi-enzymatiques, lenzyme régulateur
est inhibé de façon spécifique par le produit
terminal de la voie métabolique X , chaque fois
quil se trouve en excès par rapport aux besoins.
Ce type de régulation est appelée rétrocontrôle
(inhibition par feed-back).
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Exemple dallostérie lhexokinase
Lhexokinase est une enzyme de la membrane
plasmique  catalyse une réaction de transfert de
phosphate et dénergie du coenzyme ATP vers le
glucose quelle active en glucose-6-phosphate. Un
proton est libéré. La réaction couplée est
exergonique et irréversible. Le
glucose-6-phosphate, produit de la réaction
catalysée, est en outre un régulateur
allostérique de lhexokinase. Il se fixe sur un
site de liaison différent du site actif et cette
fixation diminue laffinité du site actif pour le
glucose. Il en résulte un ralentissement de la
vitesse de réaction.
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• Intéractions Protéines Ligands
• Introduction
• La quantification des sites de fixation d'un
  ligand sur une protéine nécessite en général la
  mesure de la concentration de ligand lié à la
  protéine à l'équilibre thermodynamique.
• Protéine à un site de fixation
• La fixation à l'équilibre d'un ligand sur une
  protéine qui possède un site de fixation pour ce
  ligand est régie par un équilibre thermodynamique
  
• K1
• P L P-L
  PL/P-L K-1/K1 Kd
• K-1
• P concentration de la protéine libre,
• L concentration de ligand libre,
• P-L concentration de la protéine complexée.

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Ces 3 concentrations étant définies lorsque
l'équilibre thermodynamique est réalisé. En
utilisant la relation de conservation de la
protéine (Pt P P-L) on en déduit que
P-L

• dépend de Pt, de Kd et de la concentration de
  ligand libre selon une loi hyperbolique
• P-L Pt x (L/KdL)
• On parle alors d'une saturation Michaelienne (par
  analogie avec l'équation de Michaelis donné pour
  la vitesse d'une réaction enzymatique).
• L'expression de P-L complexe formé, est
  constituée de deux termes indépendants
• Pt concentration totale de la protéine

• (L/KdL) ne dépend que du rapport L/Kd
  qui varie entre 0 et 1, et renseigne sur le degré
  de saturation de la protéine, on l'appelle la
  fonction de saturation Ÿ. Sa valeur est égale à
  0,5 (demi-saturation) quand la L libre (L0,5)
  est égale à Kd.

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Remarque Lorsque l'on est présence d'un
équilibre plus complexe (la protéine libre ou la
protéine complexée pouvant exister sous
différentes formes en équilibre les unes avec les
autres) la fonction de saturation présente une
expression similaire, mais le terme Kd, qui
correspond toujours à L0,5 , représente alors
la constante d'équilibre apparente que l'on peut
définir entre le ligand libre, la somme des
différentes espèces de protéine libre et la somme
des différentes espèces complexées au ligand
Kd (Sprotéine libre)xL
libre/Sprotéine complexée
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• Protéines à plusieurs sites de fixation pour un
  ligand
• Si une protéine possède plusieurs sites de
  fixation pour un ligand, ces sites peuvent être
  indépendants (la fixation du ligand sur un site
  étant indépendante de l'état de saturation des
  autres sites ) ou dépendants.
• a) Sites indépendants et équivalents
• Si une protéine possède n sites de fixation
  équivalents, la relation d'équilibre est vérifiée
  au niveau des sites
• sites libres L/sites occupés Kd
• Kd constante de dissociation microscopique ou
  intrinsèque.

En faisant intervenir la concentration des sites
totaux, qui est égale à n fois la concentration
de la protéine sites occupés sites
totaux x L/(KdL) nPtx L/(KdL) n
Pt Ÿ.
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La fonction de saturation de l'ensemble des sites
est égale à la fonction de saturation de chacun
des sites. On définit aussi V, le nombre moyen de
sites occupés par protéine V
sites occupés/Pt n L/(KdL) n ý.
La concentration de ligand lié est égale à la
concentration de sites occupés. Elle augmente
avec la concentration de ligand libre selon une
loi hyperbolique pour atteindre une valeur limite
quand tous les sites sont occupés
ligand lié ligand liémax .
L/(KdL). ligand lié et ligand liémax
sont souvent appelées B et Bmax respectivement (B
vient de l'anglais "bound" qui signifie lié)
B Bmax .
L/(KdL).
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II Analyse des données expérimentales
Lorsque les concentrations de ligand lié sont
connues pour différentes concentrations de ligand
libre, l'analyse mathématique permet de mettre en
évidence que l'on est en présence d'une ou
plusieurs lois hyperboliques (et donc que
l'interaction implique l'existence d'un ou de
plusieurs équilibres ) et de déterminer le nombre
de sites de fixation et leurs constantes de
dissociation. Le nombre de sites de fixation se
déduit de la concentration maximale de ligand que
l'on peut lier (tous les sites étant alors
occupés). Si Pt la concentration de
protéine, est connue, on peut déterminer n, le
nombre de sites de fixation par molécule de
protéine. Mais on peut aussi bien déterminer un
nombre de sites par cellule, ou de moles de
ligand lié par mg de protéine.
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1) Sites équivalents La concentration de
ligand lié suit une loi hyperbolique en fonction
de la concentration de ligand libre. Plusieurs
méthodes d'analyse des hyperboles existent. Les
méthodes de linéarisation permettent de vérifier
graphiquement que l'on est en présence d'une
simple hyperbole, et de déterminer les paramètres
qui la caractérisent.

• Les deux représentations les plus couramment
  utilisées ont été décrites initialement pour
  lineariser l'expression de (ligand lié/Pt)
  en fonction de L
• - Représentation de Klotz 1/V 1/n (1/n
  Kd/L).
• Représentation de Scatchard V/L n/Kd -
  V/Kd.
• Tout paramètre proportionnel à V peut être
  utilisé dans ces représentations, la
  signification des intersections avec les axes des
  abscisses et des ordonnées étant modifiée. En
  particulier, on utilise souvent la représentation
  de " Scatchard" pour linéariser l'équation de
  ligand lié en fonction de L
• ligand lié/L
  ligand liémax/Kd - ligand lié/Kd.

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2) Sites indépendants et non équivalents La
représentation de Scatchard n'est plus linéaire,
et il est très difficile de déterminer les
valeurs de Bmaxi et de Kdi par des méthodes
graphiques. Le principe d'une telle analyse peut
se résumer ainsi pour une concentration donnée
de ligand libre, le ligand lié est la somme du
ligand lié à chaque classe de sites. Dans la
représentation de Scatchard, les données
correspondent à la fixation sur une classe de
sites s'alignent sur une droite caractéristique
de la linéarisation de l'hyperbole. L'ensemble
des points correspondent à une même concentration
de ligand libre L et à différentes valeurs de
ligand lié s'alignent, quant à eux, sur une
droite passant par l'origine et de pente 1/L
déterminer à partir d'une représentation de
Scatchard non linéaire, les paramètres de
fixation sur chaque classe de sites consiste donc
à définir les droites correspondent à chacune de
ces classes qui permettent de retrouver la courbe
originale lorsque l'on calcule, pour chaque
concentration de ligand libre, la somme des
concentrations de ligand lié à chaque classe de
sites.
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c) Fixations spécifiques et non spécifiques
Une fixation non spécifique est observée en
général lorsque l'on étudie la fixation de
ligands sur des préparations membraneuse, est
définie comme une fixation sur des sites très
nombreux mais de très mauvaises affinité pour le
ligand. Elle s'oppose à la fixation spécifique,
qui a lieu sur un nombre limité de sites et avec
une bien meilleure affinité. La constante de
dissociation des sites non spécifiques est très
grande devant la concentration de ligand libre
utilisée. Avec cette approximation, la
concentration du ligand aux sites non spécifiques
est proportionnelle à la concentration de ligand
libre utilisé, avec le facteur de
proportionnalité Knon spécifique. Lorsque l'on
est en présence de fixation non spécifique et de
fixation spécifique sur une seule classe de
sites, la courbe de la concentration de ligand
lié en fonction de la concentration de ligand
libre est la somme d'une droite et d'une
hyperbole ligand lié Bmax
L/(KdL) Knon spécifique L.
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• L'évaluation de la fixation non spécifique se
  fait le plus souvent en utilisant, outre le
  ligand radioactif qui se fixe avec une bonne
  affinité sur les sites spécifiques étudiés, un
  ligand non radioactif qui lui, aussi, se fixe
  avec une bonne affinité sur les sites spécifiques
  et avec une très mauvaise affinité sur les sites
  non spécifiques.
• Lorsqu'il est utilisé en large excès devant le
  ligand radioactif, son effet inhibiteur
  compétitif se manifeste seulement vis-à-vis des
  sites spécifiques.
• Protéine ? ? en large excès
  . mesure la fixation non
• 
  spécifique
  par la R.

• Lorsque le ligand R (?) est utilisé seul, la
  fixation observée est égale à l'ensemble de
  fixation spécifique et non spécifique on
  l'appelle fixation totale.

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• Lorsque la fixation de ligand R est mesurée en
  présence du compétiteur non R (?) en excès, la
  fixation spécifique du ligand R devient
  négligeable à cause de l'effet de compétition (on
  dit que le ligand compétiteur "déplace" le ligand
  R). La fixation du ligand R que l'on mesure est
  alors égale à la seule fixation non spécifique.
• Fixation spécifique fixation
  totale - fixation non spécifique

Expériences de saturation de la liaison à
l'équilibre - Notions de Kd et de Bmax
Principe Il s'agit de mesurer la liaison
spécifique à l'équilibre, lors de l'incubation de
concentrations croissantes de ligand radioactif
(par ex. 10-12 à 10-5 M), avec une quantité
fixe de récepteur (par exemple 100000 cellules
entières exprimant des récepteurs, ou bien 10 ng
d'unepréparationdemembranescellulaires
41
Approche expérimentale caractérisation dun
récepteur par technique de liaison spécifique au
récepteur (ou binding) Cette technique utilise
des ligands qui se définissent comme tout composé
(agoniste ou antagoniste) capable de se fixer sur
un récepteur. Elle permet de définir laffinité
dun nouveau ligand pour des sites de liaison
spécifiques (récepteurs), cest à dire la
capacité de fixation du ligand à son récepteur..
Cette technique nétudie que le site de fixation
du ligand et pas la réponse biologique ou
pharmacologique. Il existe deux types de méthodes
détude de la liaison du ligand au récepteur la
méthode de saturation et la méthode de
déplacement.
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Méthode de saturation A partir dun homogénat
tissulaire ou dune préparation cellulaire ou
membranaire contenant le récepteur à étudier et
une concentration connue dun ligand radiomarqué
(3H , 14C , 125I sont les isotopes radioactifs
les plus utilisés), il est possible de définir
une liaison totale qui correspond à la somme de
la liaison du ligand à son récepteur (liaison
spécifique à forte affinité) et à dautres sites
de Liaison à faible affinité (liaison non
spécifique). La liaison non spécifique est
mesurée en présence dune quantité de ligand non
radioactif (ligand froid) suffisante pour
empêcher la fixation du ligand radioactif sur ses
sites spécifiques. La liaison spécifique
correspond à la différence entre liaison totale
et liaison non spécifique et permet de
définir laffinité du ligand pour son récepteur.
Incubation ligand radioactif (L) avec le
récepteur R (par ex sur des mb) Séparation on
élimine le marqueur libre par filtration Mesure
radioactivité du marqueur lié
k1
LR
L R
k-1
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Représentation de la liaison en fonction de la
concentration initiale en ligand
Détermination de la fixation spécifique par
méthode de saturation 1. Préparation riche en
récepteurs radioligand en concentration
croissante liaison totale 2. Préparation riche
en récepteurs ligand froid en surcharge
radioligand en concentration croissante liaison
non spécifique 3. On déduit la liaison spécifique
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• RL RL concentration de radioligand lié
  de manière spécifique
• L L concentration de radioligand libre.

Ainsi, la représentation de RL (axe des
ordonnées, y) en fonction de L (axe des
abcisses, x) est une hyperbole
RL f ( L )
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représentation de la liaison spécifique en
fonction du log de la concentration initiale en
ligand.
46
Quantifification Relation de Scatchard permet
une détermination plus précise de KD et
Bmax Ordonnée ligand lié (LR) / ligand libre
(L) Abscisse ligand lié (LR) KD (Lx
(Bmax - LR))/LR LR (Lx (Bmax - LR))/ KD en
développant et en simplifiant LR (Bmax x L)
/ (L KD) en réarrangeant LR / L (-1 / KD)
LR (Bmax / KD) soit lié / libre (-1 / KD)
lié (Bmax / KD) Y ax
b

• Unités
• Axe des x et des y même unité cpm nombre de
  sites / cellule fmol / mg de protéines. 
• Le Kd s'exprime en M (mol / l), souvent en nM ou
  pM.
• Le Bmax s'exprime en nombre de sites de
  liaison/cellule ou en fmol/mg de protéines.

Figure 4 Représentation selon Scatchard B/F
f (B).
47

• Expériences de déplacement de la liaison à
  l'équilibre - Notions d'IC50 et de Ki
  Principe
• C'est la mesure de la liaison spécifique à
  l'équilibre, d'une concentration donnée (en
  général égale au Kd) en ligand radiomarqué en
  présence d'une concentration variable et
  croissante de ligand froid (par ex. 10-12 à
  10-5 M). Le ligand froid entre en compétition
  avec le ligand radioactif pour sa liaison au
  récepteur, c'est pourquoi on peut parler de
  compétition de la liaison à l'équilibre
• Cette technique permet de démontrer qu'un ligand
  froid, se lie à un récepteur.
• d'étudier la liaison d'un ligand de faible
  affinité pour un récepteur (il est plus facile de
  disposer d'un ligand froid en grande quantité,
  que d'un ligand radiomarqué)

48
Figure 5 Représentation de la liaison totale en
fonction du log de la concentration en ligand
compétiteur froid. Axe des y cpm nombre de
sites / cellule fmol / mg de protéines. NB
la liaison totale n'est pas égale au Bmax car la
concentration en radioligand n'est pas saturante.

49
Expériences de compétition de la liaison, à
l'équilibre ( IC50 , Ki )
Figure 6 Représentation de la liaison spécifique
en fonction du log de la concentration en ligand
compétiteur froid.

• 100 liaison spécifique en l'absence de
  compétiteur froid. 
• 50 concentration en compétiteur froid qui
  déplace 50 de la liaison spécifique en ligand
  radiomarqué ( IC50).
• 0 liaison spécifique en présence d'un excès
  de compétiteur froid.

50
Equation de Cheng et Prusoff

• Cheng et Prusoff ont déterminé en 1973 la
  relation qu'il existe entre le Kd, le Ki et
  l'IC50
• Ki constante de dissociation à l'équilibre pour
  le compétiteur froid.
• Kd constante de dissociation à l'équilibre pour
  le ligand radiomarqué (affinité).
• L L concentration de radioligand libre.
• Kd représente donc bien la concentration en
  compétiteur froid qui se lie à 50 des sites
  récepteurs

51

• III- Approches expérimentales
• Mesure des concentrations de ligand lié et de
  ligand libre
• La concentration des sites de fixation demande en
  général la mesure des concentrations de ligand
  lié et de ligand libre. Plusieurs approches
  expérimentales sont possibles elles utilisent en
  général la séparation physique du ligand libre et
  du ligand lié à la protéine.
• Ainsi lorsque l'on étudie la fixation d'un ligand
  sur des protéines membraneuse, on peut
  centrifuger (ou filtrer) le mélange. Le ligand
  libre se retrouve dans le surnageant (ou le
  filtrat), le ligand lié dans le culot (ou le
  filtre).
• Si l'on travaille avec des protéines solubles, et
  que l'on étudie la fixation de petits ligands, on
  peut utiliser la filtration sur tamis moléculaire
  ou la dialyse à l'équilibre.
• La filtration sur une colonne de tamis
  moléculaire utilise les différences de migration
  des grosses molécules (la protéine avec ou sans
  ligand lié) et des petites molécules (le ligand
  libre).

52

• Dans le cas de la dialyse à l'équilibre, le
  ligand libre est capable de diffuser librement à
  travers la membrane de dialyse, alors que ligand
  lié à la protéine ne peut pas traverser la
  membrane. Une variante de cette méthode est la
  mesure de la vitesse de dialyse à travers une
  membrane cette vitesse est proportionnelle à la
  ligand libre dans la chambre de dialyse.
• La détermination de la ligand lié et de ligand
  libre peut se faire indirectement, en étudiant
  un paramètre expérimental qui varie lorsque le
  ligand passe de l'état libre à l'état lié.
• Exemple la fluorescence d'un coenzyme libre peut
  être comparée à la fluorescence de ce coenzyme
  lorsqu'il est en présence d'une concentration
  saturante d'apoenzyme. Connaissant ces deux
  paramètres, on peut, pour différentes
  concentrations d'apoenzyme calculer la
  concentration de coenzyme libre et de coenzyme
  lié.

53
Références -ANTONIOTTI .S, cours de biocatalyse
,2007 -BECKER H Eléments de biochimie Notions
denzymologie ,h.becker_at_ibmc.u-strasbg.fr -BENDAVI
D .C,2009, Enzymes et coenzymes -CHIBRAOUI
Layachi et KABBACH Wafae, Enzymologie,
2011-2012 -COLLAS .Ph Enzymologie
théorique -CORNISH-BOWDEN .A , JAMIN.M et SAKS.V
, cinétique enzymatique ,2005DELAHAYE .A,
Enzymologie, http//www.arnobio2.com -KEILLOR.J.W
, Inhibitions des réactions enzymatiques ,2004
-PAPY GARCIA.D et GARRIGUE ANTAR.L , Cinétique
enzymatique -RAISONNIER .A, 2002,Enzymologie
élémentaire -TOUSSAINT B., Les enzymes,2011 -WEINM
AN .S et MEHUL.P , Toute la biochimie, ed.
Dunod, Paris, 2004