Presentazione di PowerPoint

1
Lo studio delle correnti ioniche di singolo
canale mediante la tecnica del patch-clamp
2
Era noto da lungo tempo che attraverso la
membrana plasmatica è possibile un rapido scambio
di ioni. Tuttavia, Neher e Sakmann furono i primi
a mostrare lesistenza di canali ionici specifici
La tecnica del patch clamp
Erwin Neher Bert Sakmann Premi Nobel per la
medicina nel 1991 per lo sviluppo della tecnica
del patch-clamp rendendo possibile la
caratterizzazione di singoli canali ionici
3
Per chiarire come funziona un canale ionico, cioè
come esso si apre e si chiude, è necessario poter
registrare la corrente che lo attraversa.
Antecedentemente allera del patch-clamp ciò
appariva elusivo in quanto la corrente ionica
attraverso un singolo canale è molto piccola.
Con la tecnica del patch-clamp si poterono
superare tali difficoltà.
4
Il setup per il patch-clamp
computer
oscilloscopio
amplificatore
5
La configurazione di cell-attached
6
Registrazione di una corrente elettrica che
fluisce attraverso un singolo canale ionico
Elettrodo di registrazione micropipetta di vetro
? ?10-6 m
Resistenza della saldatura gt1 GW
Con un opportuno equipaggiamento elettronico e
opportune condizioni sperimentali è possibile
misurare questa corrente microscopica
Quando un singolo canale si apre, gli ioni si
muoveranno attraverso il canale come una corrente
elettrica
7
Quale tipo di informazioni è possibile ottenere
dalla registrazione di correnti di singolo canale?
8
Ampiezza media di singolo canale
9
Ampiezza media della corrente attraverso un
singolo canale
10
Costruzione di un istogramma di ampiezza
Chiuso
1 pA
Aperto
20 ms

• Occorre una lunga registrazione di singolo
  canale
• Si misurano le ampiezze di tutte le aperture
• Tali ampiezze vengono riportate in un grafico
  (istogramma di ampiezza)
• ll dominio dellampiezza (ascissa del grafico)
  viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno
  dei quali si associa il numero di aperture aventi
  ampiezza corrispondente

m1.7 pA
11
Misurando le correnti di singolo canale è
possibile costruire la relazione I-V a canale
aperto
La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è
generalmente lineare iopen single ? (V-EK)
La conduttanza di singolo canale (g) è un
parametro biofisico caratteristico di un certo
tipo di canale
12
Probabilità di apertura
13
Cosè la probabilità di apertura?
vale a dire,
14
Tracciati di singolo canale che mostrano Po
diverse
chiuso
0.1
aperto
chiuso
0.25
aperto
chiuso
0.5
aperto
chiuso
0.75
aperto
chiuso
0.9
aperto
15
Po nel caso di un canale voltaggio-dipendente Ess
a varia al variare del potenziale
16
Currente, conduttanza, e voltaggio
i ? (V VR) ? conduttanza del singolo
canale aperto V potenziale di membrana VR
potenziale di inversione
I NPi I corrente macroscopica N numero
di canali funzionali P probabilità che un
canale sia aperto i corrente attraverso un
singolo canale aperto
I NP? (V VR) I g (V VR) Corrente
Conduttanza ? Driving force g Conduttanza
macroscopica g N p ? se ? è costante, g è
proporzionale a P
I g (V VK)
17
Quale altro tipo di informazione può dare
lanalisi delle correnti di singolo canale?

1. Il numero degli stati in cui il canale può
   esistere
2. Il tempo medio di permanenza in ciascun stato
3. Le velocità di transizione tra gli stati

18
I tre tracciati mostrano la stessa probabilità di
apertura ma cinetiche diverse
chiuso
aperto
chiuso
aperto
chiuso
aperto
19
Durata delle aperture e delle chiusure
20
Come ricavare la distribuzione di probabilità
delle aperture e delle chiusure

• Occorre una lunga registrazione di singolo
  canale
• Si misurano le durate di tutte le aperture (e
  chiusure)
• Tali durate vengono riportate in un grafico
  (istogramma di durata)
• ll dominio temporale (ascissa del grafico) viene
  suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei
  quali si associa il numero di aperture aventi
  durata corrispondente

?chiusure950
?aperture950
21
t26 ms
t8 ms

• In particolare, t costante di tempo è un indice
  di quanto rapidamente la distribuzione declina
  verso zero
• è il tempo a cui la distribuzione è il 37 del
  suo valore iniziale
• Nel caso di uno schema cinetico a due stati (C?O)
  a1/t

22
(No Transcript)
23
Quindi, in uno schema cinetico a 2 stati MOT1/b
e MCT1/a
Se misuriamo un gran numero di tempi di apertura
successivi, che tipo di distribuzione
osserviamo? Supponiamo che un canale aperto abbia
una probabilità P 0.3 di chiudersi nei
successivi 0.1 ms. Allora, misurando 1000
aperture, circa 700 volte si avrebbero aperture
con un togt0.1ms, ecc.
24
Quando il canale è aperto vi è una probabilità
costante che esso cambi il suo stato da O a C in
un breve e definito intervallo di tempo dt,
indipendentemente da quanto a lungo già si
trovava nello stato O, o da come ci era arrivato.
Supponiamo per esempio che esista una probabilità
P0.3 che la transizione avvenga nei successivi
0.1 ms. Ciò significa che possiamo fare
predizioni statistiche circa il cambiamento da O
a C. Avendo osservato un gran numero di canali
aperti, circa nel 30 di essi il cambiamento a C
sarà avvenuto nei primi 0.1 ms. Quindi, dopo 0.1
ms il 70 di essi è ancora nello stato O. Nei
successivi 0.1 ms, un ulteriore 30 del rimanente
70 cambierà a C, e così via. Processi con tali
caratteristiche, che la probabilità di un
particolare cambiamento rimane costante in
piccoli intervalli di tempo successivi, sono
esempi di processi Markoviani.
25
Canali con più stati chiusi distinguibili
Tempi di apertura
Tempi di chiusura
t8 ms
t12.3 ms a10.4
t225 ms a20.6
Schemi cinetici possibili In questo caso le
relazioni tra i tempi medi di apertura e di
chiusura e le costanti di velocità dipendono
dallo schema cinetico scelto
26

• Importanza di
• Frequenza di campionamento
• Filtraggio dei segnali
• nella registrazione di correnti di singolo canale

Seguiranno esempi di tracciati mostranti la
perdita di informazione con una frequenza di
campionamento bassa o con un filtraggio eccessivo
27
Effetto del filtraggio su un tracciato di
corrente di singolo canale
Traccia filtrata a 10000 Hz
Traccia filtrata a 1000 Hz
In pratica per correnti di singolo canale il
filtraggio analogico del segnale è normalmente
compreso tra 5 e 3 KHz
28
Effetto della frequenza di campionamento su un
tracciato di corrente di singolo canale
Freq. camp. 0.1 ms/punto
Freq. camp. 0.4 ms/punto
Teorema del campionamento i dati dovrebbero
essere campionati ad una frequenza almeno doppia
di quella della banda passante
29
Molte informazioni sul meccanismo di
funzionamento dei canali ionici sono il risultato
di una collaborazione tra elettrofisiologi e
biologi molecolari
Supponiamo per esempio di voler testare lipotesi
che una particolare catena laterale della
proteina-canale sia implicata nel processo di
apertura/chiusura.
30
Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico