Biosparation

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Bioséparation

• Purification de protéines introduction

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Introduction

• Bioséparation opération unitaire importante des
  industries agro-alimentaire, pharmaceutiques
  ainsi que des biotechs.
• Importance croissante biotechnologies modernes,
  quantité de protéines à produire de plus en plus
  importante
• Biomédicaments développement de la médecine
  personnalisée ou médecine génomique (Hezrceptin
  pour cancer du sein 25 de réponse), SMRgt méd.
  chimiques . Sur 52 nouveaux pdts à SMR élevé,
  18 biomed., (USA, C et Inde à venir)
• AntiTNFK (polyathrite rhumatoïde, Crohn,)
  CAgt5milliard de dollards
• Cardiovasculaire
• Cancer MAB (600 pdts en devlpt), spécificité,
  moins effets secondaires
• Diabète (150M malades) insuline recombinante
  humaine
• Hepatite vaccin biotech., interferon a
• EPO
• Sclérose en plaque (interferon b)
• Maladies auto-immunes
• , développement de la protéomique,

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Introduction

• 1953 ADN
• 1986 Insuline recombinante
• 2004 190 biomédicaments, 600 pdts en dévelpt,
  très peu en fin de dévlpt en Europe (pb de
  financements), seulement 2 biotech côtées en
  bourse en Fr
• Exemple Néovax index de survie en mois!
• Bioalliance levée totale de 27M euros en 5 fois
• Medicago 30M dollars en 1 fois
• Rôle des collaborations (50 du pipe des Big
  pharma)

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Introduction

• En 2003 40 des médicaments sont des
  biomédicaments contre 17 en 1993
• 28 du pipe mondiale sont des bioméd.
• 60 du CA (32,4 Bn dollars au total) des bioméd.
  est réalisé aux USA. 30 en Europe
• 80 des bioméd sont indiqués pour des pathologies
  à fort besoin non satisfait
• 113 MAB en dévlpt clinique dont 74 en phase II
  et III (env. 100 bioméd. Sur le marché dans les 5
  ans à venir)
• Croissance du marché estimée à 14,6/an

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Protéines

• Polymères dAA
• Biopolimères les plus abondants des cellules (40
  à 70 du poids sec)
• Fonctions biologiques
• Structure (collagène, kératine,)
• Bio-Catalyseurs (enzymes, anticorps
  catalytiques,..)
• Transporteurs (hémoglobine, sérum albumine,)
• Régulateurs (hormones)
• Protecteurs (anticorps)

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Protéines

• Structure
• Primaire
• Secondaire
• Tertiaire
• Quaternaire
• Nécessité de TOUT respecter pour conserver
  lactivité (dénaturation de la lipase gastrique
  si extraction du maïs au VATRON-MAU)

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Protéines les produits

• Produits agro-alimentaires aditifs,
  nutraceutiques
• Albumine (uf)
• Caséine
• Protéines de soja
• Lysosyme
• Hydrolysats protéiques
• a lactalbumine
• Produits pharmaceutiques
• Anticorps monoclonaux (100 à 200 kg/an)
• Sérum albumine
• Immunoglobulines
• Interféron a et b
• EPO
• Facteur VIII et IX
• Urokinase,

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Produits

• Catalyseurs (pouvant être industriels grosse
  production)
• Hemicellulase
• glucose isomérase
• a amylase
• Protéases alcalines,
• Produits de diagnostiques
• Peroxydase
• Glucose oxydase
• Autres (bio-colles,)
• Cosmetique
• détergent
• enzymes digestives

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Bioseparation

• Les règles
• Réduction des volumes de départ
• Enrichissement des milieux
• Elimination des impuretés (toxines,pb spécifique
  du farming)
• Prévention des risques dempoisonnement des
  bio-catalyseurs
• Respects des spécifications (pharmacopées,
  dossiers dAMM,)
• Gestion de la stabilité, éviter des protéolyses,
  conservation de lactivité (exple pb inox,
  forces de cisaillements, solvants)

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Bioséparation

• Principales caractéristiques des protéines
• Généralement présents à très faible concentration
  dans la matière première
• Nombreuses impuretés (protéines, metabolites II)
• Thermolabiles
• Sensibles au pH et à la force saline
• Sensibles aux solvants et aux détergents
• Sensibles aux contraintes physiques
  (cisaillements)
• Exigences très élevées (pas de virus, même morts,
  pas de pesticides,
• Il faut combiner productivité, sélectivité et
  conditions opératoires douces

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Produits

• Sources animale, végétale, micro-organismes
• Procédés de purification dépendant de la pureté
  requise
• Nutraceutique gt additifs en agro
• Protéines thérapeutiques exigence cest là
  que les actions de recherche se concentrent

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Aspects économiques

• La purification de protéines dun milieu de
  biotechnologie (fermenteur,) ou dune autre
  source est un challenge difficile.
• Cest souvent le facteur limitant au
  développement dun bioproduit!! (déficit de
  plateforme de production en Europe, env. 100 des
  pdts du pipe sont américains). Le coût du
  procédé de purif prend une part importante du
  coût du produit. Cest ce qui motive les
  recherches pour améliorer les techniques de purif
  ou en introduire de nouvelles.

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Aspects économiques
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Bioséparation techniques

• De très nombreuses méthodes existent
• Il faut tenir compte de
• Volume et/ou débit initial (jus de
  fermentation,)
• Concentration de la protéine dans le milieu
• Le profil des impuretés (doit tjrs être traité en
  amont)
• Les spécifications réglementaires
• Le prix de marché

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Bioséparation techniques

• Elles peuvent être classées de la manière
  suivante
• Haute productivité, faible résolution
• Broyage cellulaire, Précipitation,
  Centrifugation, Extraction L/L (ATPS),
  microfiltration, UF, Extraction fluide
  supercritique
• Basse productivité, haute résolution
• UC, chromato colonne (SEC, IE, Affinite),
  électrophorèse, chromato FSC
• Haute productivité, haute résolution
• Chromato lit fluidisé, UF, chromatographie sur
  membranes

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Bioséparation techniques
Le schéma général suit le RIPP (Removal,
Isolation, Purification, Polishing). 1- Haute
productivité, faible résolution sur le milieu
initial (2- Haute productivité, haute
résolution) 3- Basse productivité, haute
résolution
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Techniques

• Broyage cellulaire
• Pour extraire les protéines intracellulaires
• Méthodes physiques
• Broyeur à balles, à galets
• French press, Menton-Gaulin
• Ultrasons
• Méthodes chimiques
• Détergents,
• Enzymes
• Solvants

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Techniques

• Précipitation
• Permet la mise en uvre de très grands volumes,
  favorisé par les basses températures
• Relargage par des sels (NaCl, SO4(NH4)2)
• Par des solvants (methanol, ethanol, acétone)
• Par des acides ou des bases
• Suivi dune séparation du filtrat par filtration
  ou centrifugation

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Techniques

• Centrifugation
• Séparation des protéines précipitées à
  1000-10000rpm
• Analytique (labo) 1mL à 1L
• Préparative (prod) jusquà plusieurs milliers
  de litres
• Ultracentrifugation
• 30000-100000rpm
• Analytique
• Préparative

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Techniques

• Chromatographie sur colonnes
• IE
• RP
• Interaction hydrophobe
• SEC
• Affinité (protéine A, G)
• FSC
• Chromatographie sur membranes
• Repousse certaines limites des colonnes (débits
  élevés ET résolution élevées)

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Techniques

• Microfiltration
• Séparation de particules de la taille du micron
• Récupération des cellules dun bioréacteur
• Élimination des virus
• Clarification des jus et boissons
• Purification de leau
• Stérilisation de milieux de bioréacteurs
• Electrophorèse
• Sur gel
• En phase liquide