Apoptose

1
Apoptose
2
Apoptose

• Apoptosisgrego para falling off (Caír,
  desfazer)
• Processo fisiológico de morte celular programada
• Processo activo
• Inibição deste processo é activa e altamente
  regulada
• Fases
• A Célula Compacta-se
• A membrana forma invaginações
• A cromatina condensa
• O DNA Fragmenta-se
• A célula morta divide-se em vesículas membranares
  (corpos apoptóticos) que são fagocitados

3
Os processos bioquímicos da apoptose

• Proteólise
• Fragmentação genómica
• Perda de assimetria da membrana celular
• Fragmentação celular

www.nih.gov/sigs/Aboutapo.html
4
Apoptose versus Necrose

• Apoptose
• Determinada genéticamente
• Ocorre dentro dos intervalos fisiológicos
• Célula compacata-se
• Resulta de diversos passos intrinsecamente
  regulados
• Participa no equilibrio homeostático do organismo
• Fenómeno individual celular (suícidio celular)
• Nunca ocorre perda de estanquicidade membranar
• As vesículas formadas são removidas por
  fagocitose, num processo muito rápido que não
  deixa vestígios

• Necrose
• Determinada genéticamente
• Resulta da alteração súbita de um ou mais
  intervalos fisiológicos (pH, Temperatura,
  iónicas, etc)
• Citoplasma incha
• Resulta da inviabilização metabólica da célula
• Não tem funções homeostáticas
• Fenómeno colectivo a todas as células vizinhas
• Resulta na perda de estanquicidade da membrana
• O derramamento do fluido celular inicia processos
  tecidulares (inflamação) que duram horas ou dias
  e originam marcas duradouras (cicatrizes)

5
Controlo da apoptose

• A apoptose em condições biológicas é uma resposta
  celular a variações subtis
• no meio extracelular
• Na membrana citoplasmática
• No interior da célula
• O mesmo estímulo pode desencadear apoptose num
  tipo de célula, ser inócuo noutro, e desencadear
  a proliferação noutro
• A resposta de um tipo de célula a um dado
  estímulo pode ser variável pois depende de outros
  factores celulares (exfase de maturação) e
  ambientais (outros estímulos)

6
Funções da apoptose

• Moldar os tecidos na embriogénese
• Eliminar células alteradas (ex. cancro)
• Eliminar células que deixaram de ser necessárias
  (ex. Sistema Imunológico)

7
Programmed Cell Death

• A. Form digits
• B. Form lumina
• C. Vestigal structure
• D. Mullerian/Wolffian
• E. Cull extras (neurons)
• F. Cull immune system
• G. Cull damaged cells
• focus of many studies

8
Anomalias da apoptose

• Malformações congénitas
• Doenças Neurodegenerativas
• Disfunções imunológicas
• Tumores

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Apoptose em patologias

• Cancro
• Inibição da apoptose
• HPV inactiva o promotor do p53
• EBV aumenta a produção de bcl-2
• Algumas Leucemias B expressam níveis elevados de
  bcl-2
• Melanoma inibe a expressão de Apaf-1
• Alguns tipos de cancros do pulmão e do colon
  secretam uma proteína que bloqueia o FasL
• Alguns tipos de tumores expressam níveis elevados
  de FasL induzindo apoptose nas CTL que com elas
  interactuam
• Doenças Auto-imunes
• Defeitos na indução de apoptose
• Defeitos na selecção celular
• Dificuldade em desligar as respostas imunológicas
• Imunodeficiências
• Excesso de apoptose
• Deficiências na selecção positiva

10
Regulação da apoptose

• Estudos em Caedorhabditis elegans permitiram
  identificar 4 grupos de genes
• Responsáveis por desencadear a apoptose
• Genes envolvidos no processo apoptótico
• Genes necessários para a fagocitose dos corpos
  apoptóticos
• Genes necessários para a dissolução final dos
  corpos fagocitados

bloqueio
Ced-9
detonação
apoptose
fagocitose
dissolução
Egl-1, ces-1, ces-2
Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11
Ced-1,ced-2,ced-5, ced-6, ced-7, ced-10
Nuc-1
11
Apoptose em mamíferos
bloqueio
Ced-9
detonação
apoptose
fagocitose
dissolução
Egl-1, ces-1, ces-2
Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11
Ced-1,ced-2,ced-5, ced-6, ced-7, ced-10
Nuc-1
12
A Família bcl-2
Formação de homo/hetero-dimeros
Promoção da apoptose Na ausência de BH1 e BH2
Ligação a proteínas de outras famílias
Ancoragem à membrana

• Three subfamilies
• Bcl-2 (survival, 4BH)
• Bax (apoptosis, 3BH)
• BH3 only (apoptosis)

BH bcl-2 homology domain
13
Apoptose mediada por sinais internos à célula

• A membrana da mitocondria contém bcl-2 ligado a
  Apaf-1
• Dano interno provoca
• Dissociação entre o bcl-2 e Apaf-1
• Saída de cyt-c para o citoplasma
• O cyt-c e o Apaf ligam-se a caspase-9 formando o
  apoptosoma (com ATP)
• Os apoptosomas agregam, a caspase-9 inicia uma
  cascata de activação de caspases por proteólise
• Degradação de proteínas estruturais do citosol
• Degradação do DNA nuclear

www.ultranet.com/jkimball/BiologyPages/A/Apoptosi
s.html
14
Apoptose mediana por sinais externos à célula

• Fas e o receptor do TNF são proteínas de membrana
  constitucionais
• A ligação de FasL e TNF induz
• Activação de caspase 8
• Inicia a cascata de activação de caspases
• Degradação de proteínas estruturantes
• Degradação do DNA nuclear

www.ultranet.com/jkimball/BiologyPages/A/Apoptosi
s.html
15
Apoptotic Pathways

• Extrinsic pathway the death machinery is
  triggered by death ligands interacting with DRs
  to activate initiator caspases. Intrinsic pathway
  centers on mitochondria which release cyto-c into
  the cytosol activating caspase cascade.
• The extrinsic and intrinsic death pathways can
  operate singly but crosstalk between the pathways
  occurs at many levels.
• Cyto-c binds Apaf-1 in turn binds to procaspase-9
  and activates it and the cascade.
• Smac/DIABLO released from mitochondria can bind
  to IAPs overcoming their inhibition on various
  caspases.
• The extrinsic and intrinsic death pathways are
  linked by the cleavage of Bid by caspase-8.
• Cleaved Bid translocates to mitochondria and
  induces Bax/Bak-dependent release of
  mitochondrial proteins.

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Death Receptors

• Modular Structures
• CRDcysteine rich extracellular domain
• DDcytoplasmic death domain
• Adapters/FADD,etc
• contain DDs to interact with receptors and
  transmit apoptotic signal to machinery Receptors
  have unique features to recognize ligand with
  specificity
• TNFR1/TNF-a, lymphotoxin alpha
• Fas (CD95)/FasL, DAXX
• DR3 DR4/TRAIL
• Not Death Receptors
• Other TNF members, B T cell antigens, lack DDs

17
Executioners of Apoptosis
18
Caspases A Common Pathway

• Caspases are proteases involved in 2 stages of
  the apoptotic pathway
• Caspases are synthesized as inactive procaspases
  that are activated by cleavage to form the active
  dimer
• A complex forms at the receptor that activates
  caspase-8 to initiate the pathway

19
Caspase Activation

• Synthesized as single chain precursor
• Cleavage site at conserved Asp-297
• N-peptide contains death-effector domain required
  to recruit the death receptors (DRs) to the
  cytosolic face

20
Caspase Family Members

• Structural features
• CARD (caspase recruitment domain
• DED (death effector domains) for adaptors
• Caspase cleavage
• Site separates subunits
• Substrate cleavage
• caspase cleaves motifs (P1-P4 )in substrates

21
Pro-apoptotic regulators promote caspase
activation
Figure 23-50
22
Some trophic factors prevent apoptosis by
inducing inactivation of a pro-apoptotic regulator
Figure 23-50
23
Death Machinery

• Initiators of cascade caspases-1,-8, -9, -10
• Effectors of cascade caspases-2, -3, -6, -7
• Proteins cleaved during execution phase of
  apoptosis (eg, PARP, lamin A) for irreversible
  cell death decision

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Cysteine Aspartate-specific Proteases
Caspase Substrates Cleavage motif
Caspase-1 pro-IL-1beta YVHD-A Caspase-3
PARP DEVD-G DNA-PK DEVD-N
Rb DEAD-G Caspase-8 all other
pro-caspases Caspase-9 PARP DEVD-G
procaspase-3 DEVD-G
25
Caspase Inhibitors

• Defining motif BIR baculovirus IAP repeat
• Multiple BIR domains
• CARD for caspase recruitment domain
• RING domain homolog of ubiquitin E3 adaptors

26
Caspase Inhibitors

• IAPs (inhibitors of apoptosis)
• BIR motif necessary/sufficient for anti-apoptotic
  activity
• XIAP, cIAP1, cIAP2 inhibit processing of
  procaspases-3, 6, 7 by inhibiting cytochrome-c
  induced activation of caspase-9
• FLIPS (FLICE inhibitory proteins)
• Contain 2 death effector domains (DEDS)
• DEDs interfere with FADD/caspase-8 interaction
  and activation
• Block early events of other death receptors
  (TNFR1,TRAIL/DR4)
• Peptide inhibitors
• Synthetic peptide sequences based on substrate
  binding pocket motif in positions P1-P4
  (Ac-YVAD-cho, c-DEVD-cho)

27
Apoptotic Pathways ConvergeRole of Bcl-2 Family

• Extrinsic Pathway
• Ligation of receptors
• Adaptor recruitment
• Activation of caspase-8
• Transmit death signal
• Intrinsic Pathway
• Cellular stress (x-ray/drug)
• Mitochondria integrator
• Bcl-2 family regulators
• Activation of caspase-9

28
The Bcl-2 Family Mechanism of Action

• Bcl-2/Bcl-XL/Apaf-1
• BH4 of Bcl-2 Bcl-XL bind to C-term of Apaf-1
  inhibiting binding to Casp-9
• Bcl-2 and cyto-c
• Bcl-2 directly or indirectly prevents release of
  cyto-c from mitochondria
• Bid of BH3 family mediates release of cyto-c c/o
  PT
• Bax death pathway
• BH1 and BH2 form pores
• Death caspase independent

29
Summary of Bcl-2 Family Roles
30
Mitochondrial dysfunction

• Many apoptotic stimuli use mitochondrial
  dysfuntion to signal apoptosis (intrinsic cues)
• Steroids
• Drugs (DNA damage)
• Irradiation (redox imbal)
• Loss of growth factors
• Ceramide generation
• Distinct BH3 only proteins respond to specific
  death stimuli
• Activated BH3 proteins translocate to
  mitochondrial surfaces to associate with Bcl-2
  related proteins to form membrane-spanning pores
• Cytochrome c release induces formation of the
  apoptosome, a ternary complex of cyto-c, Apaf-1
  and caspase-9
• Apoptosis disrupts mitochondrial membrane
  potential
• PT (permeability transition)

31
Mitochondrial Permeability Transition

• Effectors of PT
• Divalent cations Ca2
• ROS and nitric oxide
• Conc of some peptides (transport signal sequens)
• Lipid mediators
• Any major change in energy balance (ATP, NAD) or
  redox state
• PT functions to integrate stress responses and
  any major damage of cells will trigger PT.
• PT itself causes change in energy and redox
  balance, when massive, can lock the cell into
  irreversible stage.

32
Permeability Transition Pore

• Bcl-2 family members control PTP channel
• Bcl-2 proteins in membrane of mitochondria
• PTP a large pore induced by necrotic or apoptotic
  signals
• OM, outer membrane
• IM, inner membrane
• IMS, inner membrane space
• PT is achieved by H ion gradient generated by
  electron transport.
• The H gradient is used by the FoF1 synthase to
  synthesize ATP.
• Opening of PTP results in mitochondrial
  depolarization, uncoupling of oxidat
  phosphorylation and swelling of mitochondria
• Direct association between Bax and ANT or Bax and
  VDAC have been proposed

33
Role of Mitochondria in Apoptosis

• Releases pro-apoptotic molecules into cytosol
  upon death stimuli
• Apoptosome is formed (Cyto-c,Apaf-1, casp-9)
• Opening of PTP can release procasp-2 or -9
• Bcl-2 (tethering protein) can regulate activation
  of mitochondrial pool

34
Summary of the Players

• Death Pathways
• Triggering stimuli
• Caspases
• Bcl-2 family
• Mitochondria
• Death by apoptosis vs necrosis

35
Oncologia
36
CANCRO UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS

• A origem genética dos tumores
• Proto-oncogenes e oncogenes
• Factores de crescimento
• Receptores para factores de crescimento
• Transdutores intracelulares de sinal
• Factores de transcrição nuclear
• Proteínas de controlo do ciclo celular
• Genes de Supressão tumoral
• Os carcinogénios como mutagénios
• Agentes virais na origem dos tumores
• Oncogenes virais
• Conversão de proto-oncogenes celulares em
  oncogenes
• Activação de proto-oncogenes
• Amplificação de proto-oncogene
• A "estatística" na origem dos tumores

37
Proto-oncogenes e Oncogenes

• Proto-oncogenes
• Genes normais que depois de alterados por mutação
  originam um fenótipo tumoral
• Fazem parte do património genético de todos
• Oncogenes
• Gene resultante da alteração de um
  proto-oncogene, e que causa um fenótipo tumoral
• Fazem parte do património genético das células
  transformadas

38
Receptores para factores de crescimento
39
A GENÉTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA

• ANOMALIAS GENÉTICAS EM HEMATO-ONCOLOGIA
• Translocações cromossómicas em hemato-oncologia
• Translocações envolvendo genes das Ig ou TCR
• translocação t(814)(q24q32) e o EBV
• A t(1418) - BCL2/IgH
• Translocações que originam genes hibridos
• t(922) - bcr/abl
• t(1517) - pml/rar
• Delecções cromossómicas em hemato-oncologia
• Mutações pontuais em hemato-oncologia
• mutações no gene p53
• UTILIDADE CLÍNICA DA GENÉTICA MOLECULAR EM
  HEMATO-ONCOLOGIA
• Aprofundamento de conhecimentos
• Escolha de tratamentos específicos
• Monitorização da doença

• CANCRO UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS
• A origem genética dos tumores
• Proto-oncogenes e oncogenes
• Factores de crescimento
• Receptores para factores de crescimento
• Transdutores intracelulares de sinal
• Factores de transcrição nuclear
• Proteínas de controlo do ciclo celular
• Genes de Supressão tumoral
• Os carcinogénios como mutagénios
• Agentes virais na origem dos tumores
• Oncogenes virais
• Conversão de proto-oncogenes celulares em
  oncogenes
• Activação de proto-oncogenes
• Amplificação de proto-oncogene
• A "estatística" na origem dos tumores

40
(No Transcript)
41
Transdutores intracelulares de sinal
42
Factores de transcrição nuclear
43
Proteínas de controlo do ciclo celular (ciclinas)

• O ciclo celular é controlado por ciclinas (cdk),
  p53 e RB (entre outros factores)
• Permite uma sincronia entre o crescimento,
  duplicação de DNA e divisão nuclear
• Alterações nos genes das ciclinas podem originar
  fenótipo tumoral se
• Ocorrer alteração da expressão de uma ou mais
  ciclinas
• se ocorrem mutações nas sequências codificantes
  dos genes que codificam as ciclinas, o p53 ou o
  RB

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Genes de supressão tumoral

• Genes que suprimem o desenvolvimento de tumores
• Mutações germinais associadas com predisposição
  tumoral
• Fenótipo dominante, mas recessivo ao nível
  celular (a gtparte)
• O fenótipo depende da inactivação da cópia normal
  do gene (ex. Retinoblastoma-gene RB, um regulador
  do ciclo celular)
• Fenótipo dominante (casos raros)
• O p53 é um estimulador da apoptose que funciona
  como tetrâmero. Uma diminuição da concentração
  causada por uma mutação heterózigótica inibe a
  formação de tetrâmeros, causando um fenótipo
  dominante.

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Os carcinogéneos como mutagéneos

• Os mutagéneos são substâncias capazes de se
  interagirem com os ácidos nucleicos,
  modificnado-lhes propriedades
• Se as alterações genéticas resultantes ocorrerem
  em proto-oncogenes, genes de factores de
  crescimento, ou genes de supressão tumoral, o
  genótipo resultante pode ser tumoral

46
Conversão de proto-oncogenes celulares em
oncogenes virais
47
Oncogenes virais
48
Activação e amplificação de proto-oncogenes
49
Translocações envolvendo os genes TCR e Ig
50
Linfoma de burkit t(814) - t(822) - t(82)

• Origina a expressão do c-myc nos linfócitos B

51
Linfomas foliculares e difusos
Diagrama mostrando os cromossomas 14 e 18
normais, e os cromossomas resultantes da
translocação t(1418)(q32q21), envolvendo os
genes BCL-2 (18q21) e IgH (14q32).
52
Genes hibridos resultantes de translocções
53
Bcr/abl
Os genes BCR e ABL normais, e as translocações
que originam as proteínas p190 e p210 do gene
quimera BCR-ABL. A proteína p210 é
característica da CML, sendo a p190 a proteína
BCR-ABL encontrada na maioria dos casos de ALL
54
pml/rar
A localização cromossómica e estrutura normal dos
genes PML e RARa, e a translocação
t(1517)(q2221) que origina o gene quimera
PML-RARA.