Analyse des donnes des puces ADN

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Analyse des données des puces ADN

• On a deux images de la puce à partir des quelles
  il faut réussir à évaluer lexpression dun gène.
  On procède par rapport à un échantillon de
  référence. Pour cela, on utilise deux marqueurs
  Cy3 et Cy5 sur deux échantillon distincts (dont
  un est constitué de cellules normales et servira
  de référence). On mesure la quantité de signal
  dans la longueur d'onde démission du
  fluorochrome vert et la quantité de signal dans
  la longueur d'onde démission du fluorochrome
  rouge. Puis on normalise ces quantités en
  fonction de divers paramètres (quantité de
  matériel biologique de départ dans chaque
  condition, puissance démission de chaque
  fluorochrome, ...).
• On suppose alors que la quantité d'ADN
  fluorescent fixée est proportionnelle à la
  quantité d'ARNm correspondant dans la cellule de
  départ et on calcule le ratio fluorescence rouge
  / fluorescence verte. Si ce ratio est supérieur à
  1 (rouge sur l'image en fausses couleurs), le
  gène est plus exprimé dans la seconde culture, si
  ce ratio est inférieur à 1 (vert sur l'image en
  fausses couleurs), le gène est moins exprimé dans
  la seconde culture.

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Acquisition des données

• Scanner la puce
• Évaluer quantitativement chaque spot
• Soustraire le signal de bruit
• Normaliser
• Transformer en tables dintensités de
  fluorescence (organisme ? gènes)

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Défauts courants
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Variabilité des données de transcriptome

• Les données de puces à ADN sont très variables
  (mesures de niveaux de mARN)
• Toute mesure de milliers de valeurs trouvera des
  différences importantes dues aux fluctuations
  aléatoires (distribution normale)
• Il faut utiliser des méthodes statistiques et de
  réplication pour vérifier que les différences
  sont réelles
• Il faut utiliser des réplications réelles
  (patients différents, expériences différentes)
• Sources potentielles de problèmes
• Analyse dimage
• identifier et quantifier les spots
• Scannerisation
• Laser et détecteurs
• Chimie des marqueurs fluorescents
• Hybridisation
• Température, durée, mélange,
• Étiquetage des sondes
• Extraction dARN
• Variabilité de nature biologique

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Comparer la moyenne de deux groupes
signal
difference between group means

noise
variability of groups
_
_
XT - XC
_
_

SE(XT - XC)
low variability
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Etude des radiations

• Danger indiscutable dans certains cas. En
  particulier pour les fortes doses dirradiation.
• Quel impact des faibles doses ?
• Biologiquement aucun détecté
• Y a-t-il dautres effets ?

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Protocole expérimental

• S. Cerevisiae en croissance exponentielle
  (séquencée complètement et eucaryote avec peu de
  gènes).
• Six cultures (Irradiées I) exposées pendant 20
  heures entre 15 et 30 mGy/h
• Douze cultures non exposées (Non Irradiées NI)
• Mesure effectuées sur puce Corning où
  lhybridation a été faite avec double marquage
  fluorescent (Cy3 pour les cADN contrôles et Cy5
  pour les cADN étudiés).

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Normalisation des données

• La normalisation a été réalisée par LOWESS (
  LOcally WEighted Scatterplot Smoothing ), Julie
  PEYRE Anestis ANTONIADIS (IMAG)

Où R et G sont les niveaux dintensité de Rouge
et de Vert.
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Analyse du transcriptome sur la levure

• Lirradiation à de faibles doses est-elle
  détectable ?
• Nombre de gènes impliqués dans la réponse à une
  irradiation à faible dose ?
• Groupes de gènes impliqués dans la réponse à
  lirradiation et de quelle manière ?
• Est-il possible de deviner le traitement subi par
  une levure en regardant lexpression de son
  génome ?
• Peut-on généraliser cette approche à dautres
  types de traitements (pollutions, cancer, ...)

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Les sources de problèmes

• Présence de bruit dans les données à deux
  niveaux
• Imprécision de la mesure  bruit classique
• supposé gaussien, bruit qui est très élevé
  pour certains gènes (cf doubles mesures)
• Présence de valeurs aberrantes dues
• à un problème lors de l'hybridation
• Données déjà normalisées
• Nombreux attributs 6157 gènes
• Très faible nombre dinstances 12 cultures
  non-traitées, 6 irradiées
• Classes déséquilibrées (elles ne contiennent pas
  le même nombre d'éléments)
• Absence d'indépendance conditionnelle
  probabiliste entre les gènes

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Démarche

• Méthode directe de discrimination illusoire
  mais essayée
• On conserve les gène dont le log ratio a dépassé
  3 fois la valeur 1 (par exemple)
• Trop de  solutions 
• Aucune garantie sur chacune delles
• Prétraitement
• Sélection dattributs
• Approche directe
• Approche  wrapper 
• Approche par filtrage
• Réduction de dimensionnalité
• Groupement de gènes a priori (réseaux de
  régularisation)

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Sélection (estimation) dattributs

• Hypothèse de linéarité
• Chaque attribut pertinent a une corrélation
  directe (mesurable) avec la classe
• Quelle garantie sur chaque attribut sélectionné ?
• Sélection
• Chaque attribut passe un test
• Estimation
• On ordonne les attributs en fonction dun critère
  de performance
• Quel seuil (choisi globalement) ?
• Quelle confiance ?

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Sélection

• Techniques classiques (FOCUS, RELIEF, Wrappers,
  Embeded techniques)
• Trop peu de garantie sur chaque corrélation
  détectée (attribut)
• Comparaison à hypothèse nulle globale
• Interprétation / confirmation par les
  biologistes

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Utilisation dANOVA

• Deux classes (Irradiée / Non Irradiée)
• N(m1,s) et N (m2,s)
• Comparaison
• Variance intra-classe
• Variance inter-classes
• Hypothèse nulle H0 m1 m2
• Rejet si

significativement trop grand par rapport aux
quantiles de la foi F (k-1,n-k)
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Utilisation dANOVA (suite)

• On peut aussi calculer la p-value pour chaque
  gène et ordonner les gènes
• probabilité que le test rejette lhypothèse H0 à
  tort

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SAM (Significance Analysis of Microarrays)

• Pour chaque gène

• déviation standard

Constante gt 0

• Gènes potentiellement significatifs gènes dont
  le score d(g) est supérieur au score moyen du
  gène obtenu après permutations des classes, de
  plus dun certain seuil D
• Calcul du nombre de gènes faussement
  significatifs nombre moyen de gènes faussement
  significatifs pour chaque permutation
• Taux de fausse découverte (FDR)

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RELIEF

• Une lame L est vue comme un point dans un espace
  à p 6157 dimensions
• On cherche ses k plus proches voisins dans la
  même classe et on les note Hi (nearest Hit)
• On calcule ses k plus proches voisins dans
  lautre classe et on les note Mi (nearest Miss).
• où est la projection selon gène du point x,
  et m est le nombre total de lames.
• Le poids calculé pour chaque gène gène est ainsi
  une approximation de la différence de deux
  probabilités comme suit 
• Poids(gène) P (gène a une valeur différente /
  k plus proches voisins dans une classe
  différente) - P
  (gène a une valeur différente / k plus proches
  voisins dans la même classe)
• Algorithme polynomial Q(pm2)
• Rôle de k prise en compte du bruit
• Pas de supposition dindépendance des gènes

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RELIEF
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Sélection des attributs

• Y a-t-il vraiment de linformation dans les
  données ?
• Quels gènes retenir ?
• Avec quelle confiance ?

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Comparaison à lHypothèse nulle
Nombre de gènes dont le poids dépasse la valeur
repérée en abscisse rouge Avec les classes
réelles bleu Courbe moyenne obtenue avec
des classes aléatoires
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Précision ou rappel

• Il faut choisir entre
• Une liste contenant presque tous les gènes
  impliqués mais comportant des faux-positifs
• Une liste de gènes impliqués de manière
  quasi-certaine dans la réponse à lirradiation
  (quitte à ne pas avoir tous les gènes impliqués)

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Répartition des meilleurs gènes
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Tâche de classification

• Plusieurs techniques ont été utilisées
• Vote dexperts
• Technique du maximum de vraisemblance
• K plus proches voisins
• Essai de classification en aveugle sur six
  nouvelles lames

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Interprétation biologique
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Résultats

• Les données reflètent-elles la présence de
  lirradiation ? oui
• Combien de gènes sont-ils impliqués ? Plus de
  100
• Y a-t-il des groupes de gènes impliqués et
  lesquels ?
• Oui ATP synthesis, oxidative phosphorylation
  et oxidative stress response
• Est-il possible de déterminer si une levure est
  irradiée en regardant son transcriptome ?
• Oui et il suffit de ne regarder quun petit
  nombre de gènes

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Le gène 1575