Tema 10: Clonaci

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Tema 10 Clonación y secuenciación del DNA
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Objetivos tema 10 Clonación y secuenciación del
DNA

• Deberán quedar bien claros los siguientes puntos
• Cómo se manipula el DNA?
• Las endonucleasas (enzimas) de restricción
• Clonación del DNA DNA foráneo, vector de
  clonación, organismo huésped, selección de
  vectores
• Vectores eucarióticos
• Organismos transgénicos
• Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
• Mapas de restricción
• Polimorfismos de longitud de fragmentos de
  restricción
• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• La secuenciación del DNA

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Manipulación del DNA
Estudio de una secuencia específica de DNA que
suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de
secuencias. Aislamiento, amplificación,
secuenciación y expresión de un fragmento de DNA
específico
Esta tecnología se denomina Tecnología del DNA
recombinante, clonación génica o ingeniería
genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual
tras esta revolución tecnológica
Propiedad básica del DNA que permite su
manipulación El acoplamiento de cadenas por
complementariedad. La extraordinaria
especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso
instrumento para la identificación, aislamiento,
clonación,... De fragmentos de DNA
complementarios a uno dado
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Herramienta básica

• Endonucleasas (enzimas) de restricción -gt Enzimas
  de bacterias que reconocen secuencias de DNA
  específicas y lo cortan por el esqueleto
  azúcar-fosfato.
• Tipo I y III cortan el DNA en puntos distintos
  al de reconocimiento (al azar)
• Tipo II cortan justo en los puntos que
  reconocen, que son repeticiones invertidas o
  palíndromes

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• Dos tipos de cortes
• Corte plano
• extremos romos
• Corte escalonado
• extremos pegajosos o cohesivos

EcoRI E. Coli BamHI Bacillus amyloliquefaciens
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Herramienta básica
Las enzimas de restricción tipo II Proporcionan
una forma de cortar el DNA de cualquier origen en
secuencias específicas, produciendo por tanto una
población heterogénea de fragmentos de extremos
idénticos
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Clonación del DNA

• DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
• Vector de clonación (vehículo)
• Organismo huésped (E. Coli)
• Selección de vectores

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Vectores híbridos (quimera)
Clonación del DNA
Fragmentos de distintas procedencias que se unen
in vitro tras cortarse con la misma enzima de
restricción. Ligasa sella zona híbrida

• Vectores de clonación
• Plásmido (1 sitio de corte) 2-15 kb
• Fago ? (Lambda)
• Cósmido

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Clonación del DNA
Fago ?

• Vectores de clonación
• Fago ? (2 sitios de corte) lt 24 kb
• Cromosomas artificiales P1 (derivados del
  bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y
  100 kb

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• Vectores de clonación
• Cósmido extremos cos ? DNA plásmido (origen
  replicación) DNA foráneo cápisde. 50 kb
• BAC (cromosoma artificial bacteriano) derivado
  del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en
  la secuencia de genomas

Clonación del DNA
Cósmido
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Clonación del DNA

• Huésped E. coli
• Inserción del vector híbrido en el huésped
• Plásmido transformación (solución diluida
  cloruro de calcio) y replicación autónoma
• Fago ? (transducción, inserción en DNA huésped)
• Cósmido (transducción como fago y replicación
  como plásmido)

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• Selección de vectores híbridos
• Plásmido resistencia a antibióticos
• Fago ? Inserción en E. coli (sólo se puede
  empaquetar el DNA de ? si contiene el inserto
  foráneo)

Clonación del DNA
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• Obtención de la secuencia que se clona
• Un gen
• Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene
  intrones) uso de la transcriptasa inversa que
  hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina
  humana recombinante en bacterias)
• Síntesis automatizada de DNA in vitro a partir
  de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA
  con la ayuda del código (no región promotora ni
  controladora de la expresión) 100bp
• Fragmentos del genoma por digestión con enzimas
  de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun)
• Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos
  clonados del genoma del organismo

Clonación del DNA
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Vectores eucarióticos

• Permite obtener las máximas ventajas de genes
  eucariotas
• Vectores de levaduras cromosomas artificiales de
  levaduras (YACs)
• Plásmidos Secuencia replicadora centrómero de
  levadura (telómero levadura)
• Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Linealización (con endonucleasas) y adición de
extremos teloméricos
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• Transfección
• Introducción de DNA foráneo en eucariotas
• Organismo transgénico un eucariota con DNA
  foráneo
• Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente
  con fosfato cálcico (poco eficiente)
• Inyección en el oocito DNA incorporado en el
  cromosoma (ratones transgénicos 15 eficiencia)

Métodos transfección
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Métodos transfección

• Retrovirus parte de su genoma se reemplaza con
  DNA foráneo (ejemplo leucocitos humanos carecen
  enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon
  por infección viral)

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Métodos transfección

• Electroporación se usa corriente eléctrica para
  introducir DNA
• Liposomas DNA se encapsula en liposomas
  (vesículas de membrana artificial)
• Biolística (mitocondrias y cloroplastos) disparo
  de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA
• Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en
  plantas) y elementos móviles (Elemento P en
  Drosophila)

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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos
Población de fragmentos
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Separación fragmentos
Reptación de los fragmentos a través del gel de
agarosa
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DNA teñido con bromuro de etidio emite
fluorescencia con luz UV
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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos

• Se precisa de una sonda marcada (radioactividad,
  colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse
  como sonda
• Transferencia en Southern (Southern blotting)
• Transferencia Northern (Northern blotting) se
  hibrida con RNA

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Transferencia en Southern (esquema resumen)
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Mapas de restricción mediante enzimas de
restricción
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Polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP)
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Usos de la PCR

• Secuenciación
• DNA fósil (evolución, arqueología, historia) DNA
  traza
• Fósiles
• Mamut lanudo (40000 años)
• Abraham Lincoln (síndrome de Marfan, afecta
  tejido conectivo, fribrilina)
• Hombre Neandertal -gt Hablaba como nosotros? Color
  cabello?
• Huellas dactilares del DNA (DNA forense)

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Secuenciación de DNA
La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento
de DNA permite un conocimiento más completo de la
estructura y función de un gen.

• La base molecular de mutaciones específicas en un
  gen pueden investigarse
• Las secuencias del DNA han revelado regiones
  reguladoras comunes a todos los genes
• La comparación de secuencias de diferentes
  especies provee estimas de las tasas de evolución
  molecular
• Secuenciación de genomas estructura del genoma

Métodos Secuenciación manual (inicial) Químico
(Maxam y Gilbert 1977) Didesoxi (Sanger
1977) Secuenciación automatizada (1986,)
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Secuenciación del DNA
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Secuenciación automatizada del DNA
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Animaciones de técnicas de la genética
http//www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.h
tml