Les diff

1
Les différents principes analytiques en NFS
2
L'Hémogramme L'examen d'hématologie par
excellence
Numération des Leucocytes (GB) Numération des
Erythrocytes (GR) Dosage de l'Hémoglobine Volume
Globulaire Moyen Numération des Plaquettes
Hématocrite Calcul des constantes
Erythrocytaires (2) Formule leucocytaire Cont
rôle sur frottis si anomalie
3
La chronologie Automatisation de l'hémogramme
par étapes
Histogramme différentiel
Semi Auto GB Plt VMC GR Hb Ht
Automates Numération Formule 3 pop.
Formule 5 populations
22 par. (NFS) Rétics CD4/8
7 par. - Plt
8 par. ( Plt)
18 par. (HD)
1980
1954
1972
1994
1990
1995
4
LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES
5
La NumérationDeux principes différents

• La variation d'impédance
• Principe Coulter du nom de son inventeur. Méthode
  de référence.
• Numération des trois lignées, séparation des
  populations par des seuils, construction
  d'histogrammes
• Chez Coulter est combiné avec plusieurs concepts
  complémentaires pour une plus grande exactitude
  des résultats
• Peut être utilisé avec l'hydrofocalisation
• La mesure optique
• Associe la cytométrie en flux et la diffraction
  lumineuse. La source de la lumière peut être un
  laser ou une lampe au tungstène.

6
La variation d'impédancePrincipe Coulter
7
Correction de coïncidence Doublet ou triplet
cellulaires

• Occasionnellement deux ou trois cellules peuvent
  traverser l'orifice de comptage en même temps.
• Une impulsion de grande amplitude est générée.
• La fréquence de ces passages en coïncidence est
  statistiquement prévisible en fonction du nombre
  de cellules. Cette correction est réalisée
  automatiquement par les analyseurs.

8
Numération des globules blancs Bac de comptage
des blancs

• Comptage à partir d'une suspension cellulaire.
• Les globules rouges sont lysés.
• Toute particule d'un volume supérieur à 35 fl est
  comptée comme un globule blanc.
• Ce résultat est assujeti à une correction dite
  "correction de coïncidence".

9
Numération des Globules Rouges Bac de comptage
des Rouges/Plt

• Comptage et mesure du volume à partir d'une
  suspension cellulaire.
• Toute particule d'un volume supérieur à 36 fl est
  comptée comme un globule rouge.
• Les impulsions sont triées pour retenir celles
  correspondant au passage standard.
• Le résultat est assujeti à une correction dite
  "correction de coïncidence".

10
Construction des histogrammesRépartition des
impulsions dans des canaux
11
Numération des Globules Rouges Histogramme des
rouges
VGM

• Mise en évidence de fragments de cytoplasme ou de
  grandes plaquettes par l'analyse de L'histogramme
  à partir de 24 fl.

• La trainée correspond aux
• Passages en coïncidence
• Agrégats cellulaires
• Cellules agées
• Globules blancs

12
Numération des Globules Rouges Les paramètres
calculés

• Ht Hématocrite Ht (GR x VGM)/10
• TCMH Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine.
• Hb g/100 ml x 10
• TCMH
• Nb GR 10 6/mm3
• CCMH Concentration cellulaire moyenne en
  hémoglobine.
• Hb en g/100 ml
• CCMH x 1000
• Nb GR 10 6/mm3 x VGM

13
Numération des Globules Rouges Les paramètres
calculés

• L'IDC ou RDW
• L'IDC est une valeur statistique correspondant au
  CV calculé sur la distribution des rouges
  coefficient d'anisocytose.

200
200
200
50
100
100
50
50
100
IDC Normal lt 15,5
IDC Elevé 18
IDC très Elevé 35
14
Numération des Plaquettes Bac de comptage des
Rouges/Plt

• Comptage et mesure du volume à partir d'une
  suspension cellulaire.
• Les particules de volumes compris entre 2 et 20
  fl sont comptées en tant que plaquette.
• Le flux de balayage chasse les GR qui pourraient
  créer des impulsions parasites dans la zone
  sensible.

Zone sensible
Flux de balayage
15
Numération des Plaquettes Histogramme des Plt
VMP

• Taitement mathématique des données brutes
• Test de Log-normalité
• Lissage et extrapolation de 0 à 70 fl
• Ce traitement mathématique intègre les grandes et
  petites plaquettes tout en éliminant les
  interférences.

16
Plt lissage et extrapolationNumération juste
et élimination des interférences
Grandes plaquettes
Petites plaquettes
Interférence microcytaire
17
Plt seuils variables Les seuils variables
n'éliminent pas tous les risques d'interférence
Débris Shizocytes
Interférence microcytaires
Petites plaquettes
Grandes plaquettes
18
Numération des Plaquettes Les paramètres calculés

• Le Thrombocrite
• Tct VMP x Nb de Plaquettes
• L'IDP ou PDW
• Indice de distribution plaquettaire

19
Numération par Hydrofocalisation Bac de
comptage des rouges avec hydrofocalisation
FOCALISATION HYDRODYNAMIQUE
Pour obtenir des impulsions cohérentes, certaines
marques utilisent un principe complémentaire
L'hydrofocalisation. Les cellules sont rangées
les unes derrière les autres et poussées vers la
zone de comptage.
20
La mesure optique Le deuxième principe pour la
numération
21
La mesure optique Ce principe ne mesure que la
taille, pas le volume
Mesure du volume des Globules Rouges
Sphérisation des cellules
22
La mesure optique Compensation d'une
interference liée au contenu de la cellule
Miroir semi-transparent
Lentille
Petit angle 2/3
SOURCE
Lentille
Grand angle 5/15
Miroir semi-transparent
Cellule photoélectrique
23
La mesure de l'hémoglobine Principe
colorimétrique
Photo-détecteur

• La mesure de l'hémoglobine est réalisée dans une
  chambre spécifique sur la dilution des
  leucocytes.
• Lagent de lyse forme un complexe coloré avec
  lhémoglobine.
• Le faisceau optique traverse la cuve de mesure et
  passe à travers un filtre de 525 nm.

Source lumineuse
Filtre
Cuve de mesure
24
LA FORMULETROIS POPULATIONSCINQ POPULATIONS
25
Formule 3 populationsRôle de la lyse
différentielle (Cytolyse)
La membrane devient semi-perméable Le cytoplasme
est libéré La membrane se rétracte autour du
noyau et des granulations Le volume final dépend
de la taille du noyau, de sa lobularité et des
granulations.
26
Histogramme différentielGB Détermination des 3
sous-populations sur 5

• Reconnaissance des cellules d'après le volume
  résultant.
• Coulter 3 sous populations Ly, Mo, Gr.
• Sysmex 3 sous populations Ly, Midcells, Ne.
• Les anomalies de distribution sont signalées
• par des alarmes.

27
5 Pop critères de reconnaissance La formule
dépend de la pertinence des critères

• Volume ou taille cellulaire
• Principe Coulter pour le volume ou mesure optique
  pour la taille
• Conductivité ou Radio Fréquence (RF)
• Structure de la cellule par un courant haute
  fréquence
• Diffraction lumineuse
• Diffraction de la lumière par la cellule
• Cytochimie
• Coloration de la cellule
• Cytolyse
• Lyses différentielles des cellules
• Marquage
• Marquage par des anticorps monoclonaux
• et fluorochromes

28
Détermination de la formule Chaque société
combine un ou plusieurs critères

• Volume/Conductivité/Diffraction
• Coulter
• Taille cellulaire/Cytolyse/Cytochimie (Actvité
  peroxydasique)
• Bayer
• Volume/Cytolyses/Cytochimie (Coloration des Eo.)
• Abx
• Volume/RF/Cytolyses
• Sysmex
• Diffraction lumineuse Cytolyse
• Sysmex
• Diffraction lumineuse avec ou sans cytolyse
• Abbott CD
• Diffraction lumineuse Marquage
• Abbott CD CD 4000

29
Volume/Conductivité/Diffraction

• Beckman Coulter

30
Volume/Conductivité/Diffraction 3 mesures
physiques pour la formule complète (Coulter)
31
Analyse en 3DExploration réalisée sur plus de
8000 cellules
32
Taille cellulaire/Cytolyse/Cytochimie (Actvité
peroxydasique)

• Bayer

33
Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase)
Difraction lumineuse enregistrée sous deux angles
différents (Bayer)
Matrice PEROX
Miroir semi-transparent
Petit angle 2/3 Taille
Lentille
Lentille
Grand angle 5/15Activité Peroxydasique
Miroir semi-transparent
Traitement des cellules révélation de
l'activité peroxydasique
Cellule photoélectrique
34
Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase) Canal
basophiles
Histogramme Basophiles
Miroir semi-transparent
Petit angle 2/3 Taille
Lentille
Laser
Lentille
Grand angle 5/15Densité chromatinienne
Miroir semi-transparent
Traitement des cellules Lyse de tous les blancs
sauf des Basophiles
Cellule photoélectrique
35
Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase)
Diagramme Perox et histogramme Basos
Histogramme BASOS
Diagramme PEROX
TAILLE
TAILLE
Neutrophiles
.
LUC
.
.
.
.
.
.
.
.
.
BASOS
.
.
.
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.
.
.
.
.
.
.
Mo
.
Ly
Noyaux monolobés
Noyaux Polylobés
Eosinophiles
Débris
DENSITE/SEGMENTATION
36
Volume/Cytolyses/Cytochimie (Coloration des Eo.)

• Abx

37
Volume/Cytolyses/Cytochimie Canal Matrice (ABX)
Lampe tungstène
Absorption lumineuse
Matrice LMNE
Liquide de gainage
Volume
Traitement des cellules coloration des
Eosinophiles
38
Volume/Cytolyse/Cytochimie Canal basophiles
Mesure duVolume

• Traitement des cellules
• Lyse de tous les blancs sauf des Basophiles

39
Volume/Cytolyse/Cytochimie Canal Matrice/Canal
Basos
Matrice LMNE
Absorbance
Nombre
Eo
Bruit de fond
Ne
GCI
Basophiles
Noyaux GB
GCI
Volume
Histogramme Ba
MoBa
Ly
Volume
LyA
40
Volume/RF/Cytolyses

• Sysmex

41
Volume/RF/Cytolyses Canal Impédance/Radio
Fréquence
Impulsion RF
Courant haute fréquence
Courant continu

Source fréquence radio
Impulsion impédance
Condensateur

• Traitement des cellules
• Lyse différentielle. Elle lyse les Rouges et
  partiellement les blancs.

42
Volume/RF/Cytolyses Canal Eosinophiles et Canal
Basophiles
Canal Eosinophiles
Canal Basophiles
Traitement des cellules Lyse différentielle.
Elle lyse tous les blancs sauf les Basophiles
Traitement des cellules Lyse différentielle.
Elle lyse tous les blancs sauf les Eosinophiles
43
Volume/RF/Cytolyses Scattergramme RF/DC et
Histogrammes Eo et Ba
Nb
RF
Eo
Volume
Nb
Mo
Ba
Débris
Gr
Ly
Volume
Volume /DC
44
Diffraction lumineuse Cytolyse

• Sysmex

45
Diffraction lumineuse/Cytolyse Mesure par
cytométrie en flux
Photo-diode Grand angle
Diode Laser
Photo-diode Petit angle
Cytomètre
Destruction des Ne et Eo Ly, Mo, et Ba intacts
Lyse des hématies Coloration des Eo.
46
Diffraction lumineuse/CytolyseEnregistrement de
deux angles de diffraction
Grands angles Densité intracellulaire (8-20)
Petits angles Taille (1-6)
Faisceau laser
Petits angles Taille
Grands angles Densité intracellulaire
47
Diffraction lumineuse/CytolyseFormule Ly, Mo,
Eo, NeBa
Mo
NeBa
Diffraction petits angles
Ly
Eo
Débris
Diffraction grands angles
48
Diffraction lumineuse/CytolyseDétermination de
la 5 ème pop les Neutrophiles
Ne 100 - Ly - Mo - Eo - Ba
Ba
Diffraction petits angles
Mo Ly
NeEo
Schizocytes
Diffraction grands angles
49
Diffraction lumineuse avec ou sans cytolyse
complémentaire

• Abbott

50
Diffraction lumineuse Diffraction multiangles
MAPSS (ABBOTT)
Laser ARGON
Granulations Eosinophiles
PMT1
90 Dépol.
90 Pol.
PMT2
Lobularité
Complexité.
7
Numération Taille
0
51
Diffraction lumineuse Angles de diffraction et
critères de reconnaissance
90Pol/ 90dep Granulations
10 Structure
1/3 (0) Taille
Faisceau laser
Polarisation
1/3 (0) Taille
10 Structure
52
Diffraction lumineuse Diffractogrammes
90 Dépolarisé
Taille
NeEo
Mo
Eo
Ly
Ba
Ne
Débris
Structure
90 Polarisé
53
Cytolyse complémentaire

• Abbott (CD 3200)

54
Cytolyse le NOCCD 3200

• Comptage optique des noyaux nus
• Une action plus forte de la lyse provoque la
  destruction des membranes et la libération des
  noyaux.

55
Diffraction lumineuse Marquage

• Abbott

56
Marquage à l'iodure de propidium CD 4000
Laser ARGON
Granulations Eosinophiles
PMT1
90 Dépol.
Lobularité
90 Pol.
PMT2
PMT3
Complexité.
Viabilité Blcs Erythroblastes
7
Numération Taille
0
57
Analyse de la fluorescence Marquage des noyaux
accessibles
Lkc viables
Les noyaux nus des cellules lysées et les noyaux
des cellules mortes sont marqués par l'iodure de
propidium
Lkc non viables
Noyaux nus
58
LE MARQUAGE D'AUTRES TYPES CELLULAIRESRETICULOCY
TESCD4/CD8
59
RéticulocytesNouveau bleu de méthylène
60
RéticulocytesMarquage flurescent sur ARN
Fluorescence verte
Laser ARGON
Réticulocytes
PMT1
Filtre FL1 auto commutable
PMT2
PMT3
Complexité.
7
Numération Taille
0
61
RéticulocytesFluorescence vs Complexité
62
Lymphocytes T4/T8Marquage des sites CD4/CD8 par
cytosphères (Ag-Ac)