Nukleov

1
Nukleové kyseliny

• Význam genetické informace, její replikace
• a exprese pro živý organismus
• DNA struktura, vlastnosti a funkce v
  organismu
• RNA dtto
• Virus ( parazitující soubor genu)
• Možné využití syntetických oligonukleotidu
• Technické použití nukleových kyselin
  aptamerové senzory, DNA nanomateriály

2
Znaky živého organismu

• získávání energie z živin pro své životní
  potreby
•    možnost rustu, diferenciace a reprodukce
• aktivní udržování vnitrní usporádanosti
•    aktivní reakce na zmeny vnejších podmínek

Všechny tyto životní projevy se realizují
primárne na úrovni bunek
3
Jednotná molekulární strategie bunek
Polysacharidy a lipidy stavební a zásobní
Bílkoviny (proteiny) univerzální, mohou mít
funkci stavební, zásobní, biochemickou
(enzymy), transportní, pohybovou,
kontrolní, signální,.. Specifický vztah mezi
strukturou a funkcí posloupnost
aminokyselin ? struktura ? funkce Kritická
podmínka pro zachování životních pochodu bunky
mít možnost podle potreby vytvorit protein pro
zabezpecení dané funkce
To zajištují Nukleové kyseliny v DNA je
informace uložená, RNA je prostredníkem její
realizace (exprese)
4
Centrální dogma molekulární biologie
Prenos genetické informace v živých organismech
vždy DNA ? RNA ? protein
5
Chemické složení DNA
DNA je polymerní retezec, vzniklý polymerací
nukleotidu. Nukleotid báze deoxyribóza
fosfátová skupina
Asymetrický retezec s jasne rozlišeným 5 a 3
koncem.
6
Usporádání DNA
DNA je v bunkách ve forme dimeru tvoreného
antiparalelne usporádanými retezci s
komplementárním bázovým složením.
7
Rozsah bunecné genetické informace
Kompletní genetická informace organismu
genom. Prokaryota Genom obsahuje typicky
jednotky tisíc genu. Existují však i primitivní
bakterie s méne než 100 geny. __________________
______________________________ Eukaryota
Desetitisíce až statisíce genu v genomu.
Primitivní eukaryota nemají o mnoho více genu než
nejlépe geneticky vybavená prokaryota (kvasinka
Saccharomyces cerevisiae má 6 tisíc genu).
8
Príklad genu
9
Uložení DNA v bunce
Genom prokaryot je uložen v jediné molekule DNA,
která je cyklická. _______________________________
___________________ V prípade eukaryot je genom
predstavován sadou molekul DNA, které jsou
základem jednotlivých chromosomu. Napríklad
somatické (nepohlavní) lidské bunky obsahují dve
sady po 23 chromosomech. V každém chromosomu je
DNA o délce kolem 10 cm. Délka a pocet DNA
molekul v jádre vylucuje jejich volné uložení.
Proto dochází k nekolikastupnové organizaci. Ta
je maximální pri príprave pro bunecné delení, kdy
jsou zformovány chromosomy. Pri ostatních
životních fázích bunky dochází k cástecnému
rozvolnení struktura DNA podpurné proteiny
chromatin
10
Vyšší stupne usporádání
Nukleosomy jsou vázány na další vláknový histon a
tvorí 30 nm vlákno. To je dále zprohýbáno a
organizováno.
Díky usporádání je délka chromosomu 10.000x menší
než délka rozvinuté DNA. Pri ostatních životních
fázích bunky dochází k rozvolnení. Málo
rozvolnený chromatin (heterochromatin) je
nedostupný pro expresi genetické informace. I v
nejvíce rozvolneném chromatinu zustává struktura
nukleosomu. Základní pochody na DNA, tj.
replikace, transkripce nebo opravy mohou probíhat
pres nukleosomy.
11
Usporádání v jádre
V jádre se chromosomy ( molekula DNA histony)
usporádávají do více a méne rozvinutých oblastí.
12
Predávání a rekombinace genetické informace
Genetická informace pri diferenciaci bunek nemizí
13
Replikace DNA
Presnost replikace prostá syntéza DNA vlákna
pravdepodobnost chyby 1100000
bezprostrední kontrola a oprava
pravd. chyby 1100 další kontrola a oprava na
novém vláknu pravd. chyby 1100 Celková
pravdepodobnost chyby pri replikaci 1 1
miliarda
14
Duležitost predávání genetické informace
Je to predevším pojistka proti soucasnému
poškození životne duležitých genu u celého
spolecenství jednotlivcu
U bakterií je možné predání malého množství DNA
prímo mezi jedinci, nebo i z okolí bunky. Dobre
se uplatnují plasmidy, malé kruhové DNA
U eukaryot se deje predávání genetické informace
pri pohlavním rozmnožování Somatické bunky jsou
diploidní mají vždy 2 páry chromosomu, jeden od
otce a jeden od matky, které se spojily pri
oplození, kdy se do jednoho jádra dostaly
chromosomy z samcní i samicí podhlavní bunky.
15
Zápis genetické informace
U všech organismu se zápis genetické informace
realizuje v molekule DNA deoxyribonukleová
kyselina a to poradím ctyr bází Adenin,
Cytosin, Guanin, Thymin
Prenos genetické informace podle principu
KOMPLEMENTARITY pouze bázové páry AT, GC
16
Co je prícinou principu komplementarity ?
17
Stabilita dvojšroubovice DNA
Relativne velká citlivost na vnejší podmínky
teplota, tlak, pH, koncentrace kationtu,
koncentrace jednotlivých vícemocných iontu
Závislost stability na stavbe DNA - délce
retezce - bázovém složení stabilita roste s
podílem GC páru

• Zvláštní struktury DNA
• podmínené speciálním bázovým složením
• - alternující G a C .levotocivá
  šroubovice
• pouze A a G v jednom vlákne .trojšroubovice
• pouze G . .kvadruplex
• - úsek pouze s A a T s alternacemi ohyb

18
RNA - chemické složení
Chemické složení RNA se od DNA liší pouze ve dvou
detailech Místo báze Thymin je Uracil (Uracil
nemá methylovou skupinu) Místo deoxyribózy je
ribóza (má OH skupinu v pozici 2)
19
Role RNA
Centrální dogma molekulární biologie Prenos
genetické informace v živých organismech
vždy DNA ? RNA ? protein
RNA molekuly se úcastní v procesu exprese
genetické informace ve 4 rolích mRNA (informacní)
nese informaci o poradí aminokyselin rRNA
(ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (krome
proteinu) tRNA (transferová) prenašec
aminokyselin pri syntéze proteinu na ribosomu
krátké RNA úcast pri post-transkripcních
úpravách
20
Postup exprese genetické informace
RNA molekuly se úcastní v procesu exprese
genetické informace ve 4 rolích mRNA (informacní)
nese informaci o poradí aminokyselin rRNA
(ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (krome
proteinu) tRNA (transferová) prenašec
aminokyselin pri syntéze proteinu na ribosomu
krátké RNA úcast pri post-transkripcních
úpravách
21
Strukturní rysy RNA
RNA se zásadne vyskytuje jako jednovláknová, muže
ale vytváret lokální interní dvojšroubovice a
stabilizovat se ve složité prostorové strukture.
Základními strukturními motivy jsou vlásenka
(hairpin, hairpin loop) - obsahuje vlastní smycku
a stonek (stem), výdut (bulge), vnitrní smycka,
krížení (junction)
22
Struktura 5konce viru HIV-1

• TAR vlásenka, na kterou se vážou proteiny
  virový Tat a bunecný CyclinT1
• DIS (SL1) vlásenka, která je zodpovedná za
  držení obou homologních vláken viru pri sobe

23
Viry

• Samostatne existující skupiny genu. Mohou se
  replikovat pouze pokud infikují vhodnou
  hostitelskou bunku. Nebunecné cástice, nepovažují
  se za živý organismus.
• Mimo hostitelskou bunku nevykazují životní
  projevy nemají látkový ani energetický
  metabolismus, nerostou, nejsou dráždivé, nemají
  aktivní pohyb, nerozmnožují se. Žádný z viru
  neobsahuje geny klícové pro jeho replikaci,
  predevším pro stavbu ribosomu nebo syntézu ATP.
•  
• V procesu své reprodukce predstavují
  vnitrobunecné parazity, kterí jsou zpravidla
  patogenní pro hostitelskou bunku.
• Obsahují 3 až stovky genu a jejich velikosti se
  pohybují od 15 do cca 400 nm.

24
Životní cyklus DNA viru
Lytický cyklus s využitím bunecného aparátu
(permisivita bunky) se replikuje nukleová
kyselina i virové proteiny. Kapsidové proteiny se
v procesu tzv. maturace samovolne skládají a
vytvárejí kapsid, sestavují se nové viriony.
Konkrétní mechanismus závisí predevším na tom,
jak je realizován zápis virových genu DNA viry
- prímá transkripce a translace virové DNA
25
Životní cyklus retroviru
RNA je virovou reverzní transkriptázou prepsána
do DNA a ta je virovou integrázou vclenena do
bunecné DNA v jádre
26
Použití oligonukleotidu k uspání genu
oligonukleotid krátký úsek nukleové kyseliny

• Motivace
• Chemoterapie
• Selektivní likvidace nežádoucích organismu
• Potlacení reprodukce viru, predevším retroviru
• Potlacení rustu vlastních bunek s patogenním
  chováním
• 2. Molekulární biologie
• Efektivní zkoumání funkcí rízených jednotlivými
  geny

27
Možné mechanismy
Antigenní oligonukleotid se váže na
dvojšroubovici DNA a vytvárí triplex blokuje
transkripci (vznik mRNA) Antisensní
oligonukleotid se váže na mRNA a vytvárí duplex
blokuje translaci (syntézu proteinu) nebo
dokonce vede ke štepení mRNA pomocí RNasy H
Aptamerní oligonukleotid zabranuje funkci
proteinu zajištujícímu nezbytný krok v
realizaci genetické informace (reverzní
transkriptáza, integráza, apod.) siRNA
krátká dvojšroubovice RNA obsahující nežádoucí
sekvenci Ribozymy speciální RNA sekvence
katalyzující štepení mRNA
28
Chemicky modifikovaná analoga nukleových kyselin
Krátké úseky prírozených nukleových kyselin
nejsou v bunecném prostredí stabilní pusobení
štepících enzymu (nukleázy)
První generace antisense léku Založené na
fosforothioátech Aktivují RNázu H Desítky
prípravku ve stadiu klinických testu, jeden lék
povolen pro lékarské použití Problémem je
nespecifická vazba na nukleové kyseliny a proteiny
Druhá a tretí generace antisense léku Založené
na ochranných O-methyl nebo O-methoxy-ethyl
skupinách, nekdy v kombinaci s fosforothioáty
(2.generace) nebo jiné typy modifikací
(3.generace) Neaktivují RNázu H, reší se to
tvorbou chimerických oligonukleotidu Více než
desítka ve stadiu klinických testu
29
Výber z prehledu testovaných prípravku
30
Žádná z dosud používaných modifikací nemá bohužel
optimální vlastnosti, aby se mohl plne využít
potenciál antisensní strategie
To je motivace pro hledání nových, vhodnejších
modifikací
Požadavky na syntetická analoga nukleových
kyselin pro terapeutické použití

• dostatecná stabilita vuci enzymum v bunce
  štepícím nukleové kyseliny
• specifická afinita k cílovému úseku prirozené
  nukleové kyseliny
• s komplementární bázovou sekvencí
• - pro antisense aplikaci schopnost aktivovat
  enzym RNáza H
• -  úspešné pronikání do bunek a správná
  distribuce
• ve vnitrobunecném prostredí
• - netoxicnost a to ani metabolických produktu

31
Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních
interakcí strukturních motivu prirozených i
modifikovaných nukleových kyselin
Studované problémy tvorba a rozpad duplexu,
triplexu a kvadruplexu vliv vnejších podmínek
pH, jednotlivé kationty, speciální
molekuly stabilita a dynamika duplexu s neúplnou
komplementaritou struktura, dynamika a interakce
s enzymy regulacních úseku DNA interakce s
enzymy (HIV integráza, RNasa H) významné pro
terapii interakce vazebných strukturních motivu
s aptamery (TAR smycka) pronikání
oligonukleotidu do bunek a jejich vnitrobunecný
osud
32
Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních
interakcí strukturních motivu prirozených i
modifikovaných nukleových kyselin
Používané metody UV absorpce Ramanova
spektroskopie senzory na bázi rezonance
povrchových plasmonu mikrokalorimetrie strukturn
í a dynamická NMR merení cikulární dichroismus
(v UV absorpci) gelová elektroforéza mikrofluore
scencní techniky pocítacové modelování
33
Testování syntetických oligonukleotidu
Testování vazby na prirozený retezec SPR
biosenzor
34
Specificita vazby (výsledky UV absorpce)
35
stabilita komplexu s prirozeným vláknem,
strukturní podobnost (UV absorpce, pocítacové
simulace, Ramanuv rozptyl)
biochemický test aktivace RNasy H