Title: SEMINARIO 7 Maestr
1SEMINARIO 7Maestría en Biología Molecular médica
- Miguel Alcón Álvarez
- Valeria Descalzi
- Graciela Klein
- Sergio Morales
- Marcelo Regueiro
2Receptor de Glucocorticoides (GR)
? Factor de Transcripción activado por
ligando ? Al unirse a esteroides, interacciona
con sitios específicos del genoma a
través de sub- unidades mediadoras
regulatorias, pudiendo activar o reprimir la
expresión génica
3Estructura del Receptor Glucocorticoide
4Modelo de activación génica hormona dependiente
mediado por un receptor nuclear
5Sub-Unidades Mediadoras Regulatorias
Co-activadores
Complejo Mediador
Complejo SWI/SNF
?
Proteínas p160 ?SRC1 ?TIF2/GRIP1
?Otras
Factores de remodelación de la Cromatina
Puente molecular entre los DA y la RNA Pol II
6MED14 and MED1 Differentially Regulate
Target-Specific Gene Activation by the
Glucocorticoid Receptor
- Weiwei Chen, Inez Rogatsky, and Michael
Garabedian - Departments of Microbiology (M.J.G.), Urology
(M.J.G.), and Pharmacology (W.C.) and New York
University Cancer Institute, New York University
School of Medicine and Cornell University School
of Medicine
Molecular Endocrinology, March 2006, 20
(3)560-572
7Introducción
? Las sub-unidades MED 14 y MED 1
interactúan con los GR a través de sus
dominios AD1 y AD2
Hittelman AB, EMBO J, 185380-5388
? Se han identificado de 10 genes target
inducibles por GR presentes en células de
osteosarcoma que difieren en sus
requerimientos por AD1 y AD2
RogatskyI,Proc Natl Acad Sci USA 10013845-13850
8Hipótesis
Las subunidades MED14 y MED1 del complejo
mediador regulan en forma diferenciada la
activación transcripcional, gen específica, a
través de su interacción con los receptores de
glucocorticoides
9Métodos
- ? Se midió la expresión del mRNA generado a
partir de la inducción con dexametasona de 4
genes target de GR presentes en células de
osteosarcoma - ? IGFBP1 (IGF-Binding protein 1)
- ? IRF8 (Interferon regulatory
factor 8) - ? GILZ (GC-inducible
leucine-zipper protein) - ? LAD 1(ladinin protein 1)
Medición en función del tiempo y dosis
acumulativas de dexametasona
10Métodos
- ? Se midió la expresión génica en presencia o
ausencia de dexametasona luego del silenciamiento
de la expresión de MED 1 y MED 14,utilizando
siRNAs - ? Se identificó la secuencia genómica de la zona
regulatoria a la que se unían GR, MED 1 y MED 14
11Métodos
- ? Se midió la expresion génica en inducida por
dexametasona luego del silenciamiento de la
expresión de TIF2, utilizando siRNA - ? Se evaluó el reclutamiento de RNA polimerasa
II mediado por GR en ausencia de sub- unidades
regulatorias
12Técnicas Utilizadas
- ? Cultivo Celular/ Transfecciones Trans.
- ? Real Time PCR
- ? siRNA / RT-PCR
- ? Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
- ? Western Blott
13Materiales
- ? Cultivos de células de osteosarcoma
- humano U2OS-hGR que expresan en
- forma estable el wild type GR
- ? RNAs de Interferencia (iRNAs)
- ? 2 siRNA para MED 14 (siMED14)
- ? 4 siRNA para MED 1 (siMED1)
- ? 1 siRNA específico para Luciferasa
(siCTRL1) - ? 1 siRNA no específico control
(siCTRL2) - ? 1 siRNA variante resistente MED14
(MED14v)
14Materiales
- ? Plásmidos para Transfecciones Transcientes
- ? pRK5-HA-MED 14
- ? pRK5-HA-MED 14 v
- ? pRK5-HA-MED1
- ? p-GAL4-Luciferasa
- ? GAL4-VP16
- Células transfectadas en medio libre de suero
usando 10 µl de Lipofectamina y 10 µl de
reactivo Plus (Invitrogen)
15Materiales
- ? Anticuerpos para técnicas de ChIP (1) e
Inmunoblotting (2) - 1- Ac policlonal (conejo) contra MED14 (1)
- 2- Ac monoclonal (ratón) contra MED1 (2)
- 3- Ac policlonal (conejo) contra MED1 (1)
- 4-Ac contra receptor glucocorticoideo (1)
-
16Materiales
- ? Bases de Datos Consultadas
-
UCSC human genome database (http//genoma.cse.ucsc.edu/) Regiones diana de genes target
DBTSS database (http//dbtss.hgc.jp) Sitios de inicio de la transcripción
Alibaba2.1 (www.gene-regulation.com) GREs y otros factores de transcripcion
17Análisis Estadístico
- ? Se utilizó el test de Student
- ? Los resultados fueron expresados en media SD
- ? Un valor de p lt 0.1 fue considerado
significativo
18(No Transcript)
19DIFERENCIAS EN LA CINÉTICA DE INDUCCIÓN Y CURVA
DOSIS / RESPUESTA FRENTE A DEXAMETASONA
- Se analizaron 4 genes regulados por
glucocorticoides (GR) en células de osteosarcoma
humano U20S. - IRF8
- LAD1
- IGFBP1
- GILZ Estructura
básica de GR
20Se analizaron estos 4 genes los cuales son
fuertemente inducibles por glucocorticoides y
presentan diferentes requerimientos para AF1 o
AF2.
- La acumulación de mRNA tiempo y dexametasona
dependiente, sugirieron estos diferentes
requerimientos de cofactores para la expresión
génica receptor-dependiente.
21 La expresión de los genes investigados se
determinó por Real Time - PCR.Se
observa que existe una relación temporal y
dosis dependiente ( dedexametasona) en la
expresión de todos los genes en estudio.Fig.
1 Inducción de genes dianapor glucocorticoides (
temporal y ligando dependiente)
22ANÁLISIS DEL GRÁFICO
- Fig. 1A. Concentración de mRNA de IGFBP1 y GILZ
inducidos 15 con dexametasona, mRNA de LAD1 y
IRF8 30 y 60 después. - LAD1, IGFBP1 Y IRF8 continúan incrementándose
exponencialmente a los 90, mientras que el mRNA
de GILZ no se acumula significativamente. - Relación de la expresión basal de mRNA
- GILZ gt IRF8 gt IGFBP1 gt LAD1
- Fig.1B. GILZ, IGFBP1 y LAD1 requirieron dosis
bajas para su inducción. IRF8 requirió dosis más
altas de dexametasona.
23CONCLUSIONES
- Bajas concentraciones de ligandos son necesarios
para la activación transcripcional de GILZ, LAD1
y IGFBP1 respecto a IRF8. - La cinética gen específica y la respuesta a
diferentes dosis de dexametasona, sugieren
diferentes mecanismos involucrados en la
inducción de GILZ, IGFBP1, LAD1 y IRF8 por GR en
células U20S.
24CÓMO INTERVIENE MED14 Y MED1 EN LA ACTIVACIÓN DE
GENES DIANA?
- Habiendo demostrado mediante transfección
transiente que MED14 y MED1 interactúan con GR a
través de AF1 y AF2 respectivamente. - Se silencia MED14 y MED1 usando pequeños RNA de
interferencia (siRNA) - Se mide la activación transcripcional de los mRNA
de los genes estudiados, en ausencia y presencia
de dexametasona mediante Real-Time PCR -
- LAD1 - -
IGFBP1 - -
GILZ - -
IRF8
25ANÁLISIS CUANTITATIVO DE mRNA inducible por GR
mediante Real-Time PCR
- Se usaron células U20S-hGR transfectada con siRNA
contra MED14 (siMED14), MED1 (siMED1), control
con siRNA luciferasa (siCTRL) y RNA total. - Reducción de los niveles de MED14 y MED1 respecto
al control usando siRNA.
26Determinación de proteínas por inmunoblotting
(Western Blot)
- A las 48 horas se extraen proteínas y se las
identifican utilizando anticuerpos contra MED14,
MED1, SCR-1, GR y Tubulina.
27RESPUESTA DE LOS GENES GR AL SILENCIAMIENTO DE
MED14 YMED1
- UTILIZANDO
- Real-Time PCR
- Células U20S transfectadas con siRNA (siMED14,
siMED1 y siCTRL1 luciferasa) - C Inducidas con 100 nm de dexametasona (2
horas) - D Inducidas con etanol
- (2 horas)
28RESULTADO
- La regulación que ejercen los GR sobre los genes
examinados permiten su agrupación en diferentes
clases. - Clase 1 ? IGFBP1 MED14 gt MED1
- Clase 2 ? LAD1 IRF8 MED14 MED1
- Clase 3 ? GILZ
Independiente de
-
MED14 y MED1
29MED14 y MED1 SON RECLUTADOS AL PROMOTOR DE GENES
DIANA DE GR.
- OBJETIVO
- Identificación de secuencias genómicas en
regiones regulatorias de IGFBP1, GILZ, IRF8 y
LAD1 ocupados por GR, MED14 y MED1 en células
U20S. - Técnica utilizada
- Inmunoprecipitación
- cromatínica (ChiP Assay)
-
30GR, MED14 y MED1 son reclutados hacia los genes
GR (dexametasona dependiente)
- Descripción esquemática de las regiones
regulatorias GILZ, IGFBP1 y IRF8. - Regiones negras Sitios de unión a GR (Primers
GL-3, IG-1 e IR-1) - Las regiones rayadas no contienen GREs y sirven
como control negativo para el ensayo de ChiP. - Las flechas representan sitios de inicio
transcripcional.
31RECLUTAMIENTO DE GR, MED14 y MED1 hacia GILZ,
IGFBP1 y IRF8
- Células U20S tratadas con etanol o dexametasona
durante 2 horas? cross linked con formaldehído. - ChiP assay realizado con anticuerpos contra GR,
MED14 y MED1. IgG de conejo como control
negativo. - Los sitios de unión a GR fueron amplificados por
PCR usando Primers gen-específicos. - El producto de PCR corrido en gel de agarosa.
- Visualizado con bromuro de etidio.
- Cuantificado mediante Health Image 1.63 Software.
32Producto del PCR corrido en gel de agarosa.
- GR, MED14 y MED1 se
- asocian a los GREs en
- regiones regulatorias
- de IGFBP1, GILZ y IRF8
- (dependientes de
- dexametasona)
-
From
mend.endojournals.org on July 15, 2006
33El reclutamiento de GR fue usado como valor
basal.La cantidad de MED14 y MED1 en relación a
GR fue determinada entre los genes.
- La señal del producto de PCR representando el 1
del input fue arbitrariamente indicado como 1. - La afinidad de MED14 hacia IGFBP1 y IRF8
comparada con GR fue mayor a la observada para la
región regulatoria GILZ. - IGFBP1gtIRF8gtgtGILZ
- Sensibilidad de los genes al silenciamiento de
MED14 - IGFBP1IRF8gtGILZ
- El reclutamiento de MED1 comparado con GR fue
similar entre genes.
34CONCLUSIONES
- MED14 es un factor GR hormona dependiente
determinante para la transcripción de IGFBP1 y
IRF8 pero no de GILZ.
35Cuáles son las otras vías de activación de GILZ?
- La inducción de GILZ requiere factores
intermediarios transcripcionales (TIF) - PROTEÍNAS p160
- Familia de cofactores que confieren actividad
transcripcional por GR y otros receptores de
hormonas esteroides como - - SRC1 (Coactivador 1 de receptor de
esteroides) - - TIF2 (Factor 2 intermediario
transcripcional) Proteína de - interacción con GR GRIP1
- - Activador de hormona tiroidea
- - Coactivador 3 asociado a receptor nuclear
- La p160 modifica la estructura cromatínica a
través de la acetilación o metilación de histonas
vía asociación a cAMP.
36siMED14 y siMED1 tienen distinto efecto sobre la
inducción de IGFBP1, IRF8,LAD1 y GILZ.
- Se examinaron las consecuencias de reducir la
expresión de TIF2 sobre estos genes. - TIF2 parece ser la más abundante p160 en U20S.
- Basados sobre estudios cinéticos, fue analizado
el reclutamiento del mediador versus el complejo
p160.
37La inducción mediada por GR de GILZ requiere
TIF2/GRIP1.La inducción dexametasona dependiente
de la expresión de GILZ es mediada por TIF2
- La introducción de siTIF2
- dentro de células U20S-hGR,
- reduce la expresión del mRNA
- de TIF2 un 75 comparadas
- con células control transfectadas
- con siRNA (siCTRL)
- Las células fueron inducidas
- con 100 nm de dexametasona
- por 2 horas y analizado por
- real-time PCR.
38Análisis de la inducción de GR dexametasona
dependiente.
- IRF8 y IGFBP1 no fueron
- afectados por la down-
- regulation DE TIF2.
- LAD1 fue levemente
- reducido.
- GILZ es significativamente
- reducido por siTIF2.
- Estos resultados sugieren que p160 TIF2
confieren activación transcripcional GR-
dependiente de los genes GILZ.
39RECLUTAMIENTO GLUCOCORTICOIDE DEPENDIENTE DE RNA
POLIMERASA II HACIA LOS PROMOTORES Y
ESTIMULADORES DE GILZ
- La inducción de GILZ parece ser independiente
de MED14 y MED1. - GR unido a la región GREs Puede reclutar a la
RNA polimerasa II? - ENSAYO
- Para contestar esto, se comprueba la unión de
la RNA polimerasa ll a los promotores y GREs de
GILZ y IGFBP1 mediante ChiP assay.
40Representación esquemática de las regiones
regulatorias de GILZ y IGFBP1 mostrando la
localización del par de primers usados en el ChiP
assay.
- PRIMERS GL-3 y IG-2 sitios de unión a GR
- PRIMERS GL-4 y IG-2 regiones usadas como control
negativo para ChiP assay. - TSS Promotores.
- FLECHAS Dirección de la transcripción.
41Unión de la RNA polimerasa II a las regiones
regulatorias de GILZ y IGFBP1.
- Células U20S-hGR fueron tratadas con vehículo o
dexametasona durante 2 horas y analizado mediante
ChiP assay usando un par de primers gen
específicos. -
42Los productos del PCR fueron corridos sobre un
gel de agarosa y visualizados con bromuro de
etidio.
- La RNA polimerasa II se recluta hacia el promotor
y el enhancer de GILZ, pero no a las regiones
aledañas. - Los GR unidos a GREs pueden llevar a la RNA
polimerasa II hacia el promotor a través de un
loop del DNA.
43Los productos del PCR obtenidos mediante ChiP
assay son cuantificados
- Mediante ChiP assay se determinó que la
Polimerasa II ocupa la región regulatoria del
GILZ.
44CONCLUSIÓN
- Los GR a nivel del gen GILZ no requieren un
mediador y reclutan directa o indirectamente a la
RNA polimerasa II, mientras que en el gen IGFBP1,
los GR si requieren de un mediador para unirse a
la enzima.
45ANTECEDENTES
- Los coactivadores MED 14 y MED 1 son subunidades
mediadoras implicadas en la regulación
transcripcional a través de receptores de
glucocorticoides (GR) - GR poseen 2 dominios de activación de función
- - N-terminal activation funtion 1 (AF1)
- - C-terminal activation funtion 2 (AF2)
- Estudios previos han revelado que los
coactivadores MED1 y MED14, permiten a los GR
regular la transcripción vía RNA polimerasa II. - Siempre se realizaron estudios sobre genes
reporteros artificiales.
46GENES REGULADOS POR RECEPTORES DE
GLUCOCORTICOIDES (GR)
- IGFBP1 (Factor de crecimiento insulino-simil 1)
- IRF8 (Interferon regulatory factor 8)
- GILZ (GC-induced leucine-zipper protein)
- LAD1 (cytoskeletal anchoring activity)
- Difieren en sus requerimientos por los sitios de
- activación AF1 y AF2.
- No son los únicos genes cuya expresión es
regulada por receptores de glucocorticoides.
47CONCLUSIONES GENERALES
- En este estudio se compararon los
requerimientos de 2 (dos) coactivadores de GR
MED14 y MED1 sobre múltiples genes GR
dependientes, a través de diferentes elementos
regulatorios (AF1, AF2 y TIF2). - La eliminación de MED14 afecta la inducción
mediada por GR sobre algunos promotores (IGBP1,
IRF8 y LAD1) pero no sobre otros (GILZ). - ENTONCES
- GILZ no se ve afectado por la disminución de
MED14, MED1 o ambas, a pesar de ser regulado por
GR. - La inducción mediante GR sobre LAD1, IRF8 y
IGFBP1 son mediador dependiente. No obstante, los
GR usan diferentes mediadores para el control de
la transcripción gen-específica.
48Expresión de mRNA en diferentes genes y su
relación a factores intermediarios.
- LAD1, IRF8 y IGFBP1 no fueron
- afectados por la down- regulation
- de TIF2, mediante siTIF2 en U20S.
- TIF2 (Factor 2 intermediario
- transcripcional)
- TIF2 es la más abundante de la
- familia de cofactores p160 en
- U20S (que modifica la
- estructura cromatínica)
- GILZ es significativamente
- reducido por siTIF2.
- Estos resultados sugieren que p160 /TIF2
confieren activación transcripcional GR-
dependiente a los genes GILZ.
49MODELOS DE ACTIVACIÓN DE GR DE LOS GENES
ESTUDIADOS
- IGFBP1 GR se une al complejo mediador vía MED14
a través de AF1. Este complejo recluta a la
maquinaria transcripcional de la RNA Pol II
(RNAPII) que se une a la región promotora del gen
e inicia la transcripción. - IRF8 recluta a MED14 no vía AF1 o en forma
indirecta por otro FT. - GILZ GR utilizan TIF2. Remodela la cromatina en
los GREs y recluta RNAPII independiente del
mediador.
50NUEVOS CONOCIMIENTOS.NUEVOS INTERROGANTES.
- El mediador es importante en la actividad y
selectividad en promotores de GR. - Algunos genes GR dependientes (GILZ), pueden
prescindir del mediador para su activación. - Otros genes (IGFBP1 o IRF8) sufren una regulación
dependiente de la concentración de mediadores
(MED 14 o MED1). - MED14 está ligado al cromosoma X.
- Esto sugiere que las mujeres presentan niveles
más altos de MED14 que los hombres. -
51HIPÓTESIS
- Existen diferencias en la expresión de genes
regulados por GR en relación al género. - Esta hipótesis está siendo actualmente testeada.
52- MUCHAS GRACIAS
- Maestría en Biología Molecular Médica
- Noviembre 2006