ELEKTROFOREZ

1
ELEKTROFOREZ
Etkin Kimyagerler Egitimleri Faydali olmasi
dilegiyle
Yüksek Kimyager Hasan ÖZ
2
ELEKTROFOREZ

• Elektroforez,dogru akimin uygulandigi bir tampon
  çözeltide yüklü taneciklerin diferansiyel göç
  hizlarina dayanan bir ayirma yöntemidir. Yüklü
  türlerin, içinden elektrik akimi geçirilen bir
  elektrolitte çözündükleri veya süspande
  olduklarinda göç etmeleri esasina dayanir.
• Kapiler Zone Elektroforez

3
Giris

• Iletken bir çözelti içindeki yüklü/yüksüz
  parçaciklarin veya moleküllerin bir elektriksel
  alan varliginda göç etmesi söz konusudur.
• Elektroforez için dört seye ihtiyac vardir
• iyonlarin hareket edebilecegi uygun bir ortam
  (destek ortami)
• uygun pHda bir tampon çözelti
• elektriksel alani olusturmak icin dogru akim
  saglayacak güç kaynagi
• birbirinden ayrilan bantlari kantitatif olarak
  degerlendirebilen dedektör

4
Tarihçe

Bu ayirma yöntemi ilk olarak Isveçli kimyaci Arne
Tiselius tarafindan serum proteinleri üzerinde
çalisirken bulunmus ve çalisma dolayi kendisi
1948'de Nobel Ödülü ile ödüllendirilmistir.
Elektroforezin kapilerde gerçeklestirilmesinin
avantajlari 1980lerin baslarinda Jorgenson ve
Lukasin çalismalari ile belirginlesmistir.
5
1897-Kohlrausch-elektrolit içindeki iyonlarin göçü

• HjertenCZE terimi,1-3 mm iç çapli kuartz kapiller

• Virtanen-0,2-0,5 mm iç çapli kapiller

• Everaertsve HovingKeulemans-politetrafluoroetilen
  kapiller(0,5 mm ID) organik asitlerin
  isotakoforetik ayrimlari

• Jorgensonve Lukacs-75 µm ID açik cam kapiller

• Terabe-Kapiller elektrokinetik kromatografi

• Microphoretic Systems,Applied Biosystems,
  Beckmann, Bio-Rad Laboratories, Spectrovision.

6
Ayrilma bilesiklerin

• Yük/kütle oranina göre,
• Afinitilerine göre,
• Partikül büyüklüklerine göre,
• Hidrofobik özelliklerine göre,
• Absorbsiyon özelliklerine göre gerçeklesir.

7
ELEKTROFORETIK AYIRMALARIN TEMELI
IYON GÖÇ HIZI
v µe E
V iyon göç hizi µe elektroforetik mobilite E Elektrik alan
µe elektroforetik mobilite q iyon yükü ?çözelti vizkositesi riyon çapi
Elektroforetik mobilite verilen iyon ve çözelti için bir karakteristiktir ve sabittir.
8
v µe E esitliginden çikarilanlar

• Elektroforetik hareketlilik analitin iyonik yükü
  ile dogru ve sürtünmeli geçiktirme katsayisi ile
  ters orantilidir.

• Elektrik alan sadece iyonlar üzerine
  etkilidir.Nötral türler birbirinden ayrilamazlar.

• Eger iki farkli tür hem farkli iyon yüküne ve hem
  de tampondan geçerken farkli sürtünme kuvvetine
  sahipse,bu iki madde birbirinden ayrilabilir.

• Analit iyonun sürtünmeli geçiktirme kuvveti ,o
  iyonun boyutuna,sekline ve içinde göç ettigi
  ortamin viskositesine baglidir.

9
Elektroforetik ayirmanin temelleri

• Ayni boyuttaki iyonlar içinyük ne kadar
  büyükse,yürütücü kuvvet ve göç hizi o kadar büyük
  olur.

• Ayni yükteki iyonlar için ise ,iyon küçüldükçe
  sürtünme kuvveti küçülür ve göç hizi artar.

• Iyonun iyon/yük orani bu iki etkiyi
  birlestirmektedir. Kromatografinin aksine
  elektroforetik ayirmada tek faz söz konusudur.

10
ELEKTROFOREZ TIPLERI
KLASIK YÖNTEM KAPILER ELEKTROFOREZ
1. Kagit elektroforezi 2. Selüloz asetat elektroforezi 3. Jel elektroforezi a. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) b. Agaroz jel elektroforezi 1.Kapiler Bölge Elektroforezi (CZE) 2.Kapiler Jel Elektroforezi (CGE) 3.Kapiler Izoelektrik Odaklama (CIEF) 4.Kapiler Izotakoforez (CITP)
5.KAPILER ELEKTROKROMATOGRAFI a.Dolgulu kolon Elektromatografi b.Micellar Elektrokinetik Kapiler Kromatografi (MECC-MEKC)
11
Klasik Yöntemler
Kagit ve Selüloz Asetat Elektroforezi
Kagit tampon çözelti ile doyurulduktan sonra, iki
ucu tampon çözeltiye batacak sekilde gerilir.
Örnek madde kagit üzerine genellikle bir çizgi
halinde sürülür. Kurumamasi için kagit hem üstten
kapatilir hem de bir su deposu üstünde tutulur.
Gerilim uygulandiktan sonra bir süre bekletilir,
süre tamamlandiginda kagit çikartilir, kurutulur
ve analiz edilir.
12
Kagit ve selüloz asetat elektroforezi
Kagit ve selüloz asetat elektroforezi
Yüksek voltajli kâgit elektroforezi en çok
peptitler ve aminoasitlerin ayirt edilmelerinde
kullanilmaktadir.Selüloz asetat elektroforezi ise
öncelikle serum proteinlerinin elektroforezinde
önemlidir.
Jel Elektroforezi
-Poliakrilamid Jel Elektroforezi
PAGE serum proteinlerinin, proteinlerin genetik
varyasyonlarinin ve izoezimlerin analizinde en
iyi sonuç veren elektroforez tipidir.
Poliakrilamid jellerle yapilan elektroforez,
örnekteki bilesenlerin daha iyi ayrismasina yol
açar. Çünkü ayirim hem moleküler elekleme, hem de
elektroforetik harekete dayanir.
13
Jelin ayristirma gücü ve molekül boyutu araligi
akrilamid ve bis akrilamid konsantrasyonuna
baglidir.Iki maddenin polimerizasyonu ile jelde
porlar olusur. Düsük konsantrasyonda daha büyük
porlar olusur ve yüksek molekül agirlikli
moleküllerin analizi yapilabilir.Yüksek
konsantrasyonlarda ise kücük porlar olusur ve
düsük molekül agirlikli moleküllerin analizi
yapilir.
14
Poliakrilamid jel birbirinden belli
uzaklikta(0,5-2,0 mm) tutulan iki cam tabaka
arasinda ve genelde 8-10 cm ya da 10-10 cm
boyutunda hazirlanir.
Polimerizasyon sirasinda jelin üst kismina
yerlestirilen plastik bir tarak jelde
küçük kuyucuklarin olusumunu saglar.Polimerizasyon
dan sonra tarak çikarilir. Kuyucuklar, tuzlari ve
polimerize olmamis akrilamidi yok etmek üzere,
tamponla yikanir.
Jel kaseti iki tampon arasina yerlestirilirkuyucu
klara örnekler konulur ve akim geçirilir.Uygun
boya ile boyanir.
15
Agaroz Jel Elektroforezi
Serum proteinleri, hemoglobin varyantlari, LDH
izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonlari ve diger
maddelerin analizi için basariyla uygulanmaktadir.
Agaroz sicak suda çözünür, sogutuldugu zaman,
karsilikli hidrojen baglarinin olusumu ile jel
yapisi olusur. Bu olusum geri dönüsümlüdür.
Örnekler, jel içine yapilan küçük kesilerle
olusturulan kuyucuklar içerisine uygulanirJelin
uçlari daha sonra içine elektrodlar
yerlestirilmis ayirici tampon tankina
daldirilir.Elektrodlar arasinda bir akim
olusturan bir voltaj uygulanir. Jelden geçen bu
akim genellikle 30 dakika civarinda sürer ve
istenen rezolüsyonu saglar. Tamponun iyonik gücü
akim miktarini ve sabit bir voltajda proteinlerin
hareketini saglar. Eger iyonik güç azsa nispeten
daha çok akim yüklü proteinler tarafindan tasinir.
16
Iyonik güç fazlaysa daha az akim daha kisa
mesafeye hareket eden proteinler tarafindan
tasinir. Jelin iletken tamponla temasi düzensizse
akim elektrodlar arasinda farkli olabilir,
proteinler daha fazla akim olan yöne daha çok
göçer. Elektroforez süresi çok uzun tutulacak
olursa proteinler jelden tampon iç içe göçer.
Elektroforezden sonra jel asetik asit gibi hafif
bir fiksatifle muamele edilir ve proteinler göç
ettikleri yerlerde çökerler. Daha sonra boyanir,
jel kurutulur ve zemini açilir.
17
(No Transcript)
18
KAPILER ELEKTROFOREZ
19
KAPILER ELEKTROFOREZIN AVANTAJLARI
20
KAPILER ELEKTROFOREZDE AYRIMI GERÇEKLESTIRILEBILEN
MOLEKÜLLER
21
KAPILER ELEKTROFOREZDE GÖÇ HIZLARI VE TABAKA
YÜKSEKLIKLERI

• v µe E esitliginde görülecegi gibi,bir iyonun
  göç hizi(v), elektrik alanin siddetine
  baglidir.Elektrik alani iseuygulanan
  potansiyelin büyüklügüne(V,volt) ve uygulandigi
  kapilerin uzunlugu L'ye baglidir.

Bu esitlik,istenilen hizli iyonik göçü ve hizli
ayirmayi saglamak için ,yüksek bir potansiyelin
uygulanmasinin gerekli oldugunu gösterir.
Hizli ayirma istenilmekle birlikte ,daha önemlisi
daha yüksek bir ayirma gücü elde etmektedir.

• Uygulanan potansiyel (V) arttikça iyonun göç hizi
  artar.

• Kapiler uzunlugu arttikça göç hizi azalir.

22
KAPILER ELEKTROFOREZDE TABAKA YÜKSEKLIKLERI
D cm2 s-1 cinsinden çözünen maddenin difüzyon
katsayisidir.

Tabaka sayisinin artmasiyla ayirma gücü
arttigindan,istenilen yüksek-ayirmali ayirmalari
basarmak için yüksek bir potansiyel uyugulanmasi
gereklidir.Elektroforezde tabaka
sayisi,kromatografinin aksine kolonun uzunlugu
ile artmamaktadir.
Kapiler elektroforez normalde 10000 ile 200000
araliginda tabaka sayisina sahipken ,HPLC'de ise
bu sayi 5000 ile 20000 arasindadir.Amino asit
için kapiler zon elektroforez yöntemi ile 3000000
tabaka sayisina ulasilirken,polinükleotidlerin
kapiler jel elektroforez yöntemi için 10000000
tabaka sayisina ulasildigi literatürlerde yer
almaktadir.
23
ELEKTROOSMOTIK AKIS
Elektriksel olarak olusturulan çözelti akisidir.
Erimis silika kapilerin iç duvarlari silanol
(Si-OH) gruplari içerir.Bu gruplar yüksek pHli
bir elektrolit çözeltisi ile temas ettiginde
iyonize olur.
Erimis silikanin iç yüzeyi
Silanol gruplarinin dissosiasyonu
24
Bu dissosiasyon kapileri eksi yüklü hale getirir.
Dissosiasyon sonucu eksi yük kazanmis kapiler iç
yüzeyi.
Elektronötraliteyi korumak için bu eksi yük
üzerine çözeltideki katyonlar çekilerek çift
tabaka olusur
Kapiler iç yüzeyinde çift tabaka olusumu.
25
Bir gerilim uygulandiginda bu katyonlar ve
onlarin etrafinda yani solvatize durumdaki su
veya çözücü molekülleri katoda dogru
hareketlenir.
Iyonlarin ve onlarin beraberindeki su
moleküllerinin bu hareketi elektroosmotik akis
adini alir
Bu akis tüm çözünenenleri genellikle dedektöre
dogru kapiler boyunca etkin bir sekilde pompalar.
Kapiler elektroforez ayirma sisteminde
elektroosmotik akisin gösterilisi.
26
EOAin kapiller duvarnda gerçeklestigini gösteren
sema
27
Elektroosmotik hareketlilik
?eo ? ? / 4 ? ? r

veo ?eo V/L
veo Elektroosmotik akis hizi V Uygulanan voltaj L Kapilerin uzunlugu
28
Zeta potansiyeli, kapiler duvarindaki asidik
silanol gruplarinin iyonizasyonu ile belirlenir.
EOF elektrolit pHina büyük ölçüde baglidir.
pH 4ün altinda iyonizasyon çok küçüktür. Bu
durumda EOF hizi önemsizdir.
pH 9un üzerinde silanol gruplari tamamen
iyonlastigi için elektroosmotik akis kuvvetlidir.
Artan elektrolit derisimi zeta potansiyelini
düsürdügünden EOF hizini azaltir.
29
EOF kapiler boyunca her noktada sabit akis hizi
üretir.
Bunun anlami elektroosmotik akisin düz kesitli
bir akis olusturmasidir.
Elektroosmotik akis kesiti
Bu akis profili, HPLC gibi çözücünün pompalandigi
sistemlerde karsilasilan, sürtünmeden dolayi
kolonun kenarlarinda daha yavas, orta kisminda
ise daha hizli bir kesit olusturan laminar akisa
göre bir avantajdir.
30
Hidrodinamik akis kesiti
Laminar akistaki homojen olmayan hiz dagilimi pik
genislemesine sebep olur.
Kapiler elektroforezde bilesenlerin ayrilmasi her
bir türün elektroforetik hareketlilikleri ile
elektroosmotik hareketliligin toplamina göre
olusur.
v (?e ?eo) V/L
?e Elektroforetik hareketlilik (Her bir iyonun
karsit yüklü elektroda dogru hareketi)
V Uygulanan gerilim
31
Yük Molekül Cinsi Göreceli göç etme sirasi
Küçük çift yüklü 1
Büyük çift yüklü 2
Küçük tek yüklü 3
Büyük tek yüklü 4
0 Küçük nötral 5
0 Büyük nötral 6
_ Büyük tek yüklü 7
_ Küçük tek yüklü 8
Büyük çift yüklü 9
Küçük çift yüklü 10
32
Ayrima Etki Eden Faktörler
Tampon Çözelti Seçimi
Tampon çözeltinin cinsi ayrilacak iyona ve
matriks iyonlarina bagli olarak
degismektedir.Uygun tampon çözelti
kullanilmadiginda girsimler artmakta ve istenilen
elde edilmemekte veya pik genislemesi
gözlenmektedir.
33
Tampon çözelti derisimi
Tampon konsantrasyonu arttikçasabit faz ile
etkilesime giren iyonlarin elektroforetik
mobilitelerinde azalma meydana gelmekte,bu yüzden
kapilerde kalma süresi artmaktadir.
34
pH Etkisi
pH arttikça iyonizasyonla birlikte analit-sabit
faz etkilesimleri artacagindan alikonma zamanlari
da artacaktir.
35
Sicaklik Etkisi
Sicaklik arttikça viskosite azalir.Dolayisiyla
?eo ? ? / 4 ? ? r formülü geregi ?eo
artacagindan alikonma zamanin azalir.
36
Uygulama Voltajinin Etkisi
Uygulama voltaji arttikça veo ?eo V/L
formülü geregince ,elektroosmotik akis hizi
artacagindan alikonma zamani azalmaktadir.
Viskosite Etkisi
Viskosite arttikça?eo ? ? / 4 ? ? r formülü
geregi ?eo azalacagindan ilgili alikonma zamani
da artacaktir.
37
ELEKTROFORETIK AYIRMA
38
KAPILER ELEKTROFOREZDE PIK BANT GENISLEMESI
Klasik elektroforezde hizli ayirma saglamak için
yüksek gerilim uygulanmasi bant genislemesine yol
açar.
CEde kapiler yüzeyinden isinin kolay
uzaklastirilabilmesi nedeniyle pik genislemesi
gözlenmez.
HPLCde laminar akis bant genislemesine neden
olur.
CEde düz kesitli elektroosmotik akis etkin
oldugu için pik genislemesi gözlenmez.
HPLCde pikler ayrilma sonrasi kolon ucundan
dedektöre aktarilirken karisma sonucu pik
genislemesi olabilir.
CEde dedeksiyon kapiler üzerinde gerçeklestigi
için pik genislemesi sorunu olmaz.
CEde moleküler difüzyon ve örnek enjeksiyonu
yönteminden ileri gelen pik genislemeleri
olabilir.
39
KAPILER ELEKTROFOREZ IÇIN CIHAZ
10-100 µm iç çap ve 40-100 cm uzunlugunda,tamponla
doldurulmus erimis silika kapiler ,içinde platin
elektrotlar bulunan iki tampon haznesi arasina
yerlestirilmistir.Numune bir uçtan verilirken
ayrilan maddeler diger uçta tayin edilir.Yüksek
potansiyelli güç kaynaginin kutubu gösterildigi
gibi olabilir veya anyonlarin hizli ayrilmasini
saglamak için ters çevrilebilir.
40
ALET BÖLÜMLERI
KAPILER
Disi poliimit koruyucu kilif ile kaplanmis
erimis silika kapilerler kullanilir.
25-75µm iç çapinda, 30-100 cm boyunda olanlar en
sik kullanillanlardir.
Kapilerin iç yüzeyi, kapiler duvarinda farkli
maddelerle kovalent baglanmak suretiyle kimyasal
olarak degistirilebilir. Kararli ve iyi ayirmalar
yapabilmek için kapiler çevresinin sicakligini
düzenlemek önemlidir.

41
Tamponlar
Sitrat, borat, asetat, fosfat ve TRIS tamponlari
sik kullanilan tamponlardir.
KAPILERIN YIKANMASI

• Fused silika kapiler için
• 1 N NaOH
• 0.1 N NaOH
• Distile su
• Çalisma elektroliti
• Organik çözücü ve kuvvetli asit

Voltaj 10-30kV
42
NUMUNE VERME
En yaygin numune verme yöntemleri,elektrokinetik
enjeksiyon ve basinç enjeksiyonudur.
43
DEDEKTÖR
HPLC'de kullanilan tüm dedektörler burada da
kullanilabilir.
Kapiler elektroforezde kullanilan dedektörler Kapiler elektroforezde kullanilan dedektörler
Tayin Yöntemi Gözlenebilme siniri (belirlenen mol)
Spektrofotometrik Spektrofotometrik
Absorpsiyon 10-15 10-13
Floresans Kolondan önce türevlendirme Kolonda türevlendirme Kolondan sonra türevlendirme 10-17 10-20 8 x 10-16 2 x 10-17
Dolayli Floresans 5 x 10-17
Termal Mercekler 4 x 10-17
Raman 2 x 10-15
Kütle Spektrometrik 1 x 10-17
Elektrokimyasal Elektrokimyasal
Iletkenlik 1 x 10-16
Potansiyometri Verilmemistir.
Amperometri 7 x 10-19
Radyometrik 1 x 10-19
Bir UV dedektörü
44
Absorbans dedektörleri
Absorbans ölçümlerinin duyarliligini arttirmak
için,ölçüm yapilan isin yolunun arttirilmasi gibi
bazi teknikler ileri sürülmüstür
45
Direk UV dedeksiyonu
Indirekt UV dedeksiyonu
FLORESANS ILE TAYIN.Yogun isin kaynagindan
faydalanarak gözlenebilme sinirlarini düsürmek
amaciyla,küçük kapilerde uyarici isini odaklamak
için lazerli cihazlar tercih edilmektedir.Lazerli
floresans tayin yöntemi kullanilarak,10 zeptamol
veya 6000 molekül tayin edilebilmistir.
46
Kütle Spektrofotometresinin dedektör olarak
kullanimi
47
-FLORESANS ILE TAYIN
Floresans yapan analitlerin veya türevlerinin
duyarlilik ve seçiciliginin artmasina yol
açar.Yogun isin kaynagindan faydalanarak
gözlenebilme sinirlarini düsürmek amaciyla,küçük
kapilerde uyarici isini odaklamak için lazerli
cihazlar tercih edilmektedir. -ELEKROKIMYASAL
TAYIN Iki çesit elektrokimyasal dedektör
kullanilmaktadiriletkenlik ve amperometri.
Elektrokimasal dedektörler ilgili problemlerden
biri ayirmada kullanilan yüksek potansiyelden
dedektör elektrotlarin izole edilmesidir.Izolasyon
için kullanilan yöntemlerden biri,dedektör
kisminin bulundugu kapiler ile diger kapiler
arasina gözenekli cam veya grafit gibi gözenekli
baglantinin eklenmesidir.
48
KAPILER ELEKTROFOREZIN UYGULAMALARI
KAPILER ZONE ELEKTROFOREZ
Ayirma çözünendeki asidik gruplarin pH kontrollü
dissosiasyonuna veya çözünendeki bazik gruplarin
pH kontrollü protonlanmasina dayanir.
Iyonik türler yük/büyüklük oranlarindaki
farkliliklara dayanarak ayrilir. Nötral
bilesenler ayrilmadan dedektöre birlikte
sürüklenir.
49
Uygulanan potansiyel ile karisimi olusturan
parçaciklar kendi iyonik hareketliliklerine göre
zonlara ayrilirlar
Çözünenin tüm kapiler boyunca göç etmesi için
gereken zaman (t), kapiler uzunlugu (L) ile
elektroosmotik ve elektroforetik hizlarin her
ikisine baglidir.
Ayirma hizini artirmak için kapiler boyunca
yüksek gerilim uygulamak gerekir.
Yüksek sicakliklarda tampon çözelti daha az
viskozdur ve örnek iyonlari elektroda dogru
hareket ederken daha az dirençle
karsilastiklarindan daha hizli göç ederler.
50
Türlerin hareketliligi iyonu komplekslestirmek
suretiyle de degistirilebilir.
Elektroosmotik akis varligi katyonlarin ve
anyonlarin tek bir analizle ayrilmasini ve
taninmasini saglar.
Bir çözünenin tüm göç etme zamani çözünenin
hareketliligi ve elektroosmotik akisin her ikisi
ile de ilgilidir.
Görünen hareketlilik elektroforetik ile
elektroosmotik hareketliliklerin toplamina
esittir.
t L / (ve veo)
51
KAPILER JEL ELEKTROFOREZ
Çesitli boyutlardaki çözünenler jelle dolu
kapiler boyunca dedektöre göç ederken bir eleme
etkisi meydana gelir.
Küçük iyonlar jel boyunca daha hizli hareket
edebilir.
Kapiler jel elektroforez
Daha büyük iyonlar jel matriksinde engellenerek
göç hizlari düsürülür.
Yaklasik olarak ayni yüke sahip olan fakat
büyüklükleri (hacimce) farkli olan proteinler
,DNA parçalari ve oligomerler gibi
makromoleküllerin ayrilmasinda önemli ölçüde
faydalanilir.
Elektroforezde en çok kullanilan jel tipi olarak
çapraz baglayici reaktiflerin bulundugu ortamda
akrilamidin ( CH2 CH - CO -NH2 )
polimerlesmesiyle meydana gelmis poliakrilamid
polimeri kullanilmaktadir
52
Polimerin gözenek boyutu,monomer ile çapraz
baglayici reaktifi arasindaki orana baglidir.
Çapraz baglayici reaktifin miktarinin
artmasi,polimerde gözenek boyutunu
küçültür.Kapiler elektroforezde kullanilan diger
jel türleri agaroz( deniz alglerinden elde edilen
bir tür polisakkarit ) metil selüloz ve
polietilen glikoldür
53
KAPILER IZOTAKOFOREZ
Örnek, iki farkli tampon çözelti arasina enjekte
edilir
Voltaj uygulamasi ile analitlerin
hareketliliklerine uygun olan sisteme dogru
hareket etmesi sonucu ayirim saglanir.
Analiz sonunda izotakoferogram adi verilen ve
analit bölgelerinin ilerleme asamasini gösteren
bir grafik elde edilir.
Bu teknigin kullanildigi herhangi özel bir
uygulamada ya anyonlar ya da katyonlar
ayrilabilir,fakat her ikisi ayni anda yapilamaz.
Numunedeki en hizli iyon ilk tamponun hemen
ardinda ve yavas iyonda sonraki tamponun hemen
önünde yer alir.
54
Bantlar olustuktan sonra hepsi de ayni hizda
hareket eder.Bantlarin ayni hizda hareket
etmeleri sebebi,potansiyelin daha hizli hareket
eden bantlar için azalirken ,daha yavas bantlar
için artmasidir.Böylece tamponlardan geçen akim
aynidir.
Izotakoforetik bir deneyde dengeye
ulasildiginda,öyle bir duruma ulasilir ki sekilde
görüldügü gibi numunedeki herbir iyon bandi
,kendine bitisik daha yavas hareket eden iyon ile
daha hizli hareket eden iyon bandi arasinda
kalacak sekilde hareket eder.Bantlar arasindaki
sinirlar oldukça kesindir.Eger çözünmüs
tanecikler daha hizli banda difüzlenecek
olursa,daha düsük elektrik alanla karsilasir ve
sonuçta onun kendi orjinal bandina gelinceye
kadar hizinin düsmesine sebep olur.
55
KAPILER IZOELEKTRIK ODAKLAMA
Pozitif ve negatif yüklü gruplari ayni anda
bulunduran amfoterik türlerin ayrilmasinda
kullanilir .
Proteinler ve amfoterik türler, pozitif
yüklerinin sayisinin negatif yüklerinin sayisina
esit oldugu bir pH degerine yani pI (izoelektrik
nokta) degerine sahiptirler.
56
Örnek kapilerin düsük pHli ucundan enjekte
edilir. Bu durumda pozitif yüklü oldugu için
kapiler boyunca dedektöre dogru göç eder.
Çözünen, pH gradienti içinde kendi pI noktasina
geldiginde yüksüzlesir ve durur. Karisimdaki
farkli çözünenler farkli pI degerlerine sahip
oldugu için gradient boyunca farkli bölgelerde
durur. Tüm bölgelerin odaklanmasi tamamlandiginda
voltaj uygulanmaya devam ederken kapilere basinç
uygulanir. Basinç, pH gradientini kapilerde
dedektöre sürükler ve bu ayrilmis bölgeler
dedektör penceresinden geçerken saptanmis olur.
57
KAPILER ELEKTROKROMATOGRAFI(CEC)
Sivi kromatografisi (LC) ve CEin bilesimi bir
tekniktir.
LCde kullanilan sabit faz yerine farkli
kromatografik malzemeler kullanilarak modifiye
edilmis kapiler kolonlar kullanilir.
Ayirim mekanizmasi, sabit faz ile hareketli faz
arasindaki dagilima dayanir.
CECde akis, voltaj uygulamasi sonucu olusan
elektroosmotik akis ile saglanir.
58
Elektrokromatografi,kapiler elektroforez ve
HPLC'nin iyi özelliklerini birlestiren hibrit bir
yöntemdir.
Iki türü vardir Dolgulu kolon ve Micellar
Elektrokinetik kapiler.
DOLGULU KOLON ELEKTROKROMATOGRAFI
Polar bir çözücü elektroosmotik basinç ile
ters-faz HPLC dolgusu ile doldurulmus kapilerden
geçer.Ayirma ,numune bilesenlerinin durgun faz
ile hareketli faz arasindaki dagilimina baglidir.
Sekilde 16 adet poliaromatik hidrokarbonun 33 cm
uzunlugunda ve 75 µm iç çapli kolondan elde
edilen elektrokromatogrami görülmektedir.Hareketli
faz,4mM sodyum borat çözeltisindeki
asetonitrilinden ,durgun faz ise 3 µm
oktadesilsilikat parçaciklarindan yapilmistir.
59
Miseler Elektrokinetik Kapiler Kromatografi
(Micellar Electrokinetic Capillary
Chromatography, MECC)
Bu yöntem kapiler zone ile ayrilamayan yüksüz
(nötral) bilesenlerin ayrilmasi için
gelistirilmistir
Ayirmada oldukça yüksek derisimde sodyum dodesil
sülfat (SDS) gibi yüzey aktif madde içeren
yüksek pHta bir elektrolit çözeltisi kullanilir.
Her yüzey aktif madde için spesifik olan bir
derisimin üzerinde yüzey aktif madde molekülleri
kümelesmeye baslar.
Bu derisim kritik misel derisimi (critical
micelle concentration, cmc) olarak adlandirilir.
Bu derisimin üzerinde kümelesen yüzey aktif
maddeler hidrofobik kismin polar olmayan bir
çekirdek, hidrofilik gruplarin ise bir dis kabuk
olusturdugu miseller olusturur.
60
SDS miselleri negatif yüklüdür.
Nötral bilesenlerin miseller tarafindan tasinmasi
Negatif yüklü oldugu için de elektroosmotik akisa
ters yönde hareket eder. Elektroosmotik akis SDS
misellerini dedektöre sürükleyecek kadar güçlüdür
Örnekteki türler, HPLCde duragan fazda
alikonulmaya benzer sekilde miselin iç kisminda
dagilima ugrarlar.
Sulu tamponlu mobil faz ve miseler yalanci
duragan faz arasindaki dagilim farki yüksüz
moleküllerin ayrilmasinin tek temelidir
61
Nötral bilesenlerin miseller tarafindan tasinmasi
62
ELEKTROFOREZ UYGULAMALARININ KULLANILDIGI ÇALISMA
ÖRNEKLERI
63
ET ÖRNEKLERINDEKI FONKSIYONEL KATKI MADDELERI
IÇIN KAPILER IZOTAKOFOREZ UYGULAMALARI
Aysen HÖL, Aneta JASTRZEBSKA, Edward SZLYK23-27
Agustos 2007,21.Ulusal Kimya Kongresi,Malatya
AmaçDomuz eti örenkerinde fosfat(V)
bilesiklerinin tayini.
IslemElektrolit olarak 10 mM HCl ve ß-alanin, ve
elektrolit olarak 5 mM heksanoik asit ve glutamik
asitin kullanildigi
iki ayri kapiler izotakoforez yöntemi ile tayin
edilmistir.
64
TERPENOID ve HIDROKSI ANTROKINON YAPISINDAKI
BITKI AKTIF MADDELERININ AYRIMI VE TAYINI IÇIN
KAPILER ELEKTROFOREZ ILE ANALIZ YÖNTEMLERI
GELISTIRILMESI VE BU YÖNTEMLERIN TÜRKIYE'DEKI
BITKI FLORASINDAKI ÖRNEKLERIN ANALIZINDE
KULLANILMASI
ADA ÇAYI ÖRNEKLERINDEKI KARSONIK VE ROSMARINIK
ASIT IÇERIKLERINI CE ILE ANALIZI
65
Elektroforez uygulamalari
Kapiler iç çapi 50 µm ,toplam uzunlugu 53 cm
etkin uzunlugu 45 cm kapiler kullanilmistir.Yikama
için 1M NaOH kullanimis,kullanim öncesi yarim
saat,her enjeksiyon arasinda 3 dakika ve 2 dakida
daha da kullanilan tamponla yikama
gerçeklestirilmistir.Ayirma voltaji 28 kV ve
injeksiyon basinci 0,005 MPa ,injeksiyon süresi 5
sn'dir.Tayinler 210 nm'de gerçeklestirilmistir.
66
Elektroforez uygulamalari

Adaçayi ekstresinin elektroferogrami.Tampon 4mM borat, pH 9.6 ,uygulan voltaj 28 kV . Pikler1-Kumarin (iç standart) 2-Karnosik asit 3-rosmarinik asit.
67
SALVIA CHINONANTHA VE SALVIA KRONENBURGI
BITKILERINDE HORMINON VE 7-0-ASETILHORMINONUN
BIRARADA TAYINI
Yapilar nötral oldugundan elektroforezle tayin
edilemezler ancak hidrofilik ve hidrofobik
gruplar tasidigindanbu iki madde ayni anda MEKC
yöntemiyle tayin edilebilmektedir.
75 µm iç çapinda ,toplam kapile uzunlugu 68 cm ,
injeksiyon ve dedeksiyon noktasi arasindaki fark
60 cm alinarak gerçeklestirilmistir.
Kapiler kullanimdan önce yarim saat 1M NaOH ,su
ile 10 dakika ve kullanilan tampon çözelti ile
10 dakika yikanmistir.
68
Elektroforez uygulamalari
Injeksiyon aralarinda 0.1 mol/L NaOH
çözeltisiyle 3 dakika,tampon çözeltisiyle 2
dakika yikanmistir.Ayirma voltaji 28 kVdir.Dalga
boyu 230 nm'ye ayarlanmistir.Ayirma elektroliti
pH 11.5 'e ayarlanan 50mM SDS ve 25 metanol
olarak belirlenmistir. Miktar tayini için
7-O-asetil horminon için 10,20,30,40,50,100
µg/ml konsantrasyonu arasinda hazirlanan standart
çözeltilerin pik alanlari ile konsantrasyonlari
arasinda kalibrasyon egrisi çizilmistir.Saflastiri
larak ede edilen horminonun pik yeri saptanmis
,horminon miktari yapi benzerligi nedeniyle
esdeger düzeltme yapilarak 7-O-asetil horminonun
kalibrasyon grafiginden saptanmistir.Sonuçta
köklerdeki horminon miktari 77,13 µg/g ve
7-Oasetil horminon miktari 58,03 µg/g olarak
bulunmustur.
69
Elektroforez uygulamalari
Salvia Chionantha kök ekstresi elektroferogrami.Pi
kler1-Horminon 2- 7-O-asetil horminon
70
Inorganik anyonlarin ve organik asitlerin meyve
sularinda ve sarapta tayini
Nevin OZTEKIN, F. Bedia ERIM,Technical University
of Istanbul, Department of Chemistry
Bu çalismada 12 adet inorganik anyon ve organik
asit karisiminin ayni anda tayini
gerçeklestirilmistir. PEI kapli kapilerler
kullanilarak polarite tersine çevrilmistir. Ancak
ayrilan iyonlar UV aktif olmadiklarindan dolayli
deteksiyon teknigi uygulanmis tampon olarak
seçilen 2,6-piridindikarboksilik asit kromofor
özelligi nedeniyle dolayli dedeksiyonu mümkün
kilmistir. Bu yöntemle klorür, sülfat, okzalat,
tartarat, malat, süksinat, iyodat, sitrat,
asetat, laktat, fosfat, propiyonat anyonlari bir
arada ayrilmistir. Yöntem çesitli meyve sulari ve
beyaz sarap içinde anyonlarin tespitine
uygulanmistir.
71
Electropherogram of a standard mixture of four
inorganic anions and eight organic acids. Peaks
1chloride, 2 sulfate, 3 oxalate, 4
tartarate, 5 malate, 6 succinate, 7 iodate,
8 citrate, 9 acetate,10 lactate, 11
phosphate, 12 propionate. Background
electrolyte 3mM PDC at pH 5.5. Injection 4 x
10-4 MPa, 6s. Concentrations of ions are 0.2 mM
for chloride, sulfate, oxalate, iodate, and
citrate, 0.1mM for others.
72
Meyve Sulari içinde Karbohidrat Analizi
Gürel A, Hizal J, Öztekin N, and Erim F.B. 2006.
Separation of carbohydrates by capillary
electrophoresis using a dipeptide as separation
electrolyte
Bu çalismada insan metabolizmasinda proteinlerle
karbonhidratlarin iliskisine dayanarak, CE de
ayirma ortami olarak 8 adet amino asit, 16 adet
mono ve disakkaridin ayrilmasi için ayirma ortami
olarak denenmistir. Ayrilan sakkaridler, glukoz,
fruktoz, sukroz, fukoz, ksiloz, ramnoz, riboz,
mannitol, ksitol, laktoz, arabinoz, liksoz,
sellibioz, maltoz, mannoz, ve galaktoztur. Glisil-
glisin 16 adet karbonhidratin ayrilmasi için en
uygun ayirma ortami olarak tespit edilmistir.
Yöntem meyve sularinda sukroz, glukoz ve fruktoz
tayinine uygulanmistir.
73
(No Transcript)
74
HLA DQA1'in PRC ÜRÜNLERININ KAPILER JEL
ELEKTROFOREZI
Sevgi YILMAZ,Salih CENGIZCerrah Pasa Tip
Dergisi,1999,30(3)221-227
HLA DQA1 lokusu Adli bilimler arastirmalari için
hizli, kolay, güvenilir bilgi alinabilen
polimorfik DNA lokusudur.
Bu çalismada, kapiller jel elektroforez (CGE)'nin
az miktarda örnege gereksinim duymasi, hizli ve
çabuk ayirim süresi, yüksek ayiriciligi, kolay
miktar hesabi ile otomasyona uygunlugu gibi
özelliklerinden yola çikilarak HLA DQA1 in PCR
ürünlerinin ayirimi amaçlanmistir.
Kapiler Jel Elektroforezinin UygulanmasiIç çapi
75 µm., uzunlugu 45 cm olan silika kapiller kolon
alinmistir. Dedeksiyon için gerekli olan optik
pencere, kapilleri kaplayan polimer tabakanin
(kapiller kasetin mercek bölümüne yakin
tarafindan 8-9 cm arasi) 0.5 cm kadar alevle
yakilmasiyla açilis ve alkolle temizlenmistir.
75
Elektroforez uygulamalari
Her deneyden önce yeni ve kapli olmayan kapiller,
1 saat 1 M NaOH, 30 dakika 0.1 M NaOH ile muamele
edilmistir. Kapiller kolondan 5 dakika, 80µL
MAPS (g-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ve 20
mL distile su karisimi (asetik asit ile pH3.5'e
ayarlanarak) geçirilmistir. MAPS çözeltisi 1 saat
oda isisinda kapiller kolonda birakilmis ve
kapiller kolon 5 dakika distile su ile
yikanmistir.4 (w/v)'lük akrilamid çözeltisine
polimerizasyonu saglamak için mililitre basina 1
µL. TEMED ve 1 mg. Potasyumpersülfat eklenerek 30
dakika boyunca kapiller kolondan geçirilmistir..
5 dakika distile suyla yikanarak kapiller
duvarina yapismayan akrilamid artiklari disari
atilmiltir. Kapiller kolon, 35 C'de 1 saat
kurutulmustur.Dökme jel elektroforezinde tiplenen
PCR ürünleri, otoklavlanmis pipet uçlariyla ve
yine otoklavlanmis mikrovial (500 µL hacimli
sise)'le konularak enjeksiyon gerçeklestirildi.
Enjeksiyon islemi tamamlandiktan sonra mikrovial
içindeki PCR ürünleri -20C'de saklanmistir. Her
enjeksiyondan önce ve sonra kapiller, çalisma
tamponu ile 3 dakika yikanmistir. Çalismamizda
kullanilan TBE Çözeltisi 89 mM Tris Base, 89 mM
Borik asit, 5 mM EDTA, 0.25 HPC (Hidroksipropil
sellüloz) dan olusacak sekilde hazirlanarak ,
NaOH ile pH 8.13 e ayarlandi. Otoklavlanarak
buzdolabinda saklanmistir
76
Elektroforez uygulamalari
Kapiler Jel Kromatografi Kosullar Kapiller
Tipi Poliakrilamid ile kapli kapiller
Enjeksiyon Tipi Elektrokinetik Enjeksiyon
Zamani 8s Voltaj -28 kV Enjeksiyon Voltaji
10 kV Akim 90 µA Standart Sicaklik 30C pH
8.13 HPC 0.25 Sonuç Kapiller JeL
elektroforezinde 31-32 dakikalar arasinda 2 pik
görülmüstür.Bu iki pikin gerçekten HLA DQA1
lokusu olup olmadigi dogrulanmistir.
77
Hemoglomin Elektroforezi
Rutin analizlerde selluloz asetat membrani,agaroz
jel kullanilarak pH 8.5 de uygulanan Hb
elektroforezi, oldukca kolay, duyarli ve hizli
bir yöntemdir.Alkali pH' da, hemoglobin molekülü
negatif yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda()
dogru göç eder. Hb'ler molekul basina düsen yük
nedeniyle, Hb Aya gore Hb S 2x, Hb C 4x daha
fazla yük tasir. Böylece anoda dogru Hb S ve Hb
C, Hb A'dan cok daha yavas hareket eder.
78
Elde edilen elektroferogramlardan yola çikarak
anemi, talesemi gibi hastaliklarin tehsisi
konmaktadir.Bu sistemler günümüzde otomasyonu
yapilmis,basit bir sekilde uygulanmaktadir.
79
(No Transcript)
80
(No Transcript)
81
Idrar Elektroforezi
Elektroforez icin en az 10 ml idrara ihtiyac
vardir. Bu minimum miktardan, optimal
konsantrasyon elde etmek icin,idrar ornegi
konsantre edilir.Idrar protein elektroforezi
proteinurinin degerlendirilmesinde
kullanilir.Multiple myeloma suphesi olan
hastalarda, Bence Jones proteinlerinin tesbit
edilmesi icin tercih edilen bir metotdur. Idrar
elektroforezi, daima serumla birlikte yapilir,
boylece sonuclar direkt olarak karsilastirilabilir
.
82
Kaynaklar
-Douglas A.Skoog,F.James Holler,Timothy
A.Nieman,ENSTRÜMANTAL ANALIZ,Bilim
Yayincilik,Fifth Edition. -Leman YALÇINTEPE
GÜNESTUTAR, Macide CANTÜRK RODOP,NEW APPROACHES
IN ELECTROPHORESIS,Review Paper,Sigma Journal of
Engineering and Natural Sciences Mühendislik ve
Fen Bilimleri Dergisi,27,151-160,2009. -Vildan
Fidanci,ELEKTROFOREZ UYGULAMALARI VE KLINIK
LABORATUVAR,2010. -Uzm. Ecz. Emirhan
NEMUTLU,KAPILER ELEKTOROFOREZ NOTLARI. -Yrd.Doç.D
r. Seda ÜNSALAN,KAPILLER ELEKTROFOREZ
,FarmasötikKimya Anabilim DaliÖgretim
Üyesi,17.01.2007. -Aysen HÖL, Aneta JASTRZEBSKA,
Edward SZLYK,ET ÖRNEKLERINDEKI FONKSIYONEL KATKI
MADDELERI IÇIN KAPILER IZOTAKOFOREZ UYGULAMALARI
,21.Ulusal Kimya Kongresi,Malatya,23-27 Agustos
2007.
83
-Leman Damla KOTAN ,SILIKA METODU ILE KEMIKTEN
DNA EKSTRAKSIYONU , YÜKSEK LISANS TEZI,Çukurova
Üniversitesi,Saglik Bilimleri Enstitüsü,Adli Tip
Anabilim Dali,Adana-2010.-Temel Bilimler
Arastirma Grubu,TERPENOID ve HIDROKSI ANTROKINON
YAPISINDAKI BITKI AKTIF MADDELERININ AYRIMI VE
TAYINI IÇIN KAPILER ELEKTROFOREZ ILE ANALIZ
YÖNTEMLERI GELISTIRILMESI VE BU YÖNTEMLERIN
TÜRKIYE'DEKI BITKI FLORASINDAKI ÖRNEKLERIN
ANALIZNDE KULLANILMAS,TÜBITAK PROJESI-PROJE
NOTBAG-2313 103T053,ISTANBUL,Ekim 2006.-Sevgi
YILMAZ,Salih CENGIZ,HLA DQA1'in PRC ÜRÜNLERININ
KAPILER JEL ELEKTROFOREZI,Cerrah Pasa Tip
Dergisi,1999,30(3)221-227-Nevin OZTEKIN, F.
Bedia ERIM,Simultaneous Determination of
Inorganic Anions and Organic Acids by Capillary
Electrophoresis,Technical University of Istanbul,
Department of Chemistry.-Erim F.B., Xu X and
Kraak J.C. 1995. Application of micellar
electrokinetic chromatography and indirect UV
detection for analysis of fatty acids, J.
Chromatogr. A 694 471-479.-Gürel A, Hizal J,
Öztekin N, and Erim F.B. 2006. Separation of
carbohydrates by capillary electrophoresis using
a dipeptide as separation electrolyte.