ELEKTROFOREZ

1
ELEKTROFOREZ
2

• Elektroforez, yüklü moleküllerin bir
  elektriksel alan uygulandiginda, sivi içeren bir
  ortamda hareket hizlarinin ölçüldügü bir
  yöntemdir. Elektroforez tüm partikül türlerinin
  göçünü sagladigindan iyontoforez terimi özellikle
  küçük iyonlarin göçünü ifade eder.

3

• Makro molekülleri(özellikle nükleik asit ve
  proteinleri) birbirinden ayirmak bazen
  saflastirmak için kullanilir.Molekülleri
  büyüklük, yük ve konformasyonlarina göre
  ayirmaya yarar.Biyokimya ve moleküler biyolojide
  uygulanan en yaygin yöntemdir.

4

• En yaygin elektroforez uygulamalari, serum
  proteinleri, hemoglobinler ve izoenzimleri
• içerir. Izoenzimlerden ise, CK, LDH ve ALP en
  yaygin olarak kullanilandir.
• Piyasadaki yaygin elektroforez enstrüman
  üreticileri Beckman Instruments, Helena
• Laboratories ve Sebia Laboratoriese ait
  olanlardir.
•  

5
Protein çalismalarinda kullanilan ilk
elektroforez yöntemi Tiselius tarafindan 1937de
tanimlanan serbest solüsyon elektroforezi,frontal
elektroforez veya moving boundary
elektroforezidir. Tiselius bir elektrolit
solüsyonunda çözünmüs olan proteinleri,
protein-elektrolit solüsyonunun bulundugu U
seklindeki kuartz bir borunun içinden elektrik
akimi geçirerek ayirmistir.
6

• pH 7.6da albumin, a, ß ve ? olarak
  isimlendirilen 4 serum protein fraksiyonunu
  saptamis ve bu bandlarin sinirlari arasindaki
  absorbans degisikligini optik olarak ölçmüstür.
  Bu teknik hala elektroforetik mobilite ve
  protein-protein etkilesimi ile ilgili
  arastirmalarda kullanilmaktadir fakat,klinik
  laboratuvarlarda rutin çalismalar için
  kullanilmaz, kompleks bir araç gerektirir,teknik
  zordur ve 0.5 mL örnek gerektirir.

7

• Zonal elektroforez terimi sellüloz kagit,
  sellüloz asetat veya agaroz jel gibi porlu bir
  destek ortaminda yüklü makromoleküllerin göçünü
  gösterir.Zonal elektroforez, elektroforetik
  destek materyali üzerinde komsu zonlardan keskin
  sinirlarla ayrilmis bir elektroforetogram saglar.
  Kati bir destek ortaminda ve pH 8.6da a
  fraksiyonu, a1 ve a2 olmak üzere iki gruba daha
  ayrilir.

8
Diger destek ortamlari olarak sellüloz
asetat membrani, agaroz jel, nisasta jel,
poliakrilamid jel vb. kullanilmaktadir. Sellüloz
asetat ve agaroz jel kullanim kolayliklari, ucuz
oluslari ve piyasadaki yayginliklari
nedeniyle klinik laboratuvarlarda daha çok tercih
edilir.
9

•  
• Elektroforez tamamlandiktan
• sonra destek ortami bir boya ile muamele
  edilerek ayrilmis fraksiyonlarin identifikasyonu
  saglanir. En yaygin kullanilan boyalar Amido
  Black, Ponceau S, Fat Red 7B ve Sudan Black
  Bdir. Ayrilan fraksiyonlarin kaliteli bir
• profilinin elde edilmesi için dansitometri
  boyanmis destek ortamda gerçeklestirilir.

10
TEMEL PRENSIBI

• Eksi yüklü moleküller(anyonlar) arti yüklü
  elektroda (katoda), arti yüklü moleküller(katyonla
  r) ise eksi yüklü elektroda (anota) hareket
  eder.Elektroforezde tampon sistem kullanilir ve
  bir ortam(kagit,selüloz asetat,nisasta,agaroz
  jeli ya da poliakrilamit) ile bir dogru akim
  kaynagi gerekir.

11
(No Transcript)
12
small large
13
DANSITOMETRI

• Önceleri sonuçlarin degerlendirilmesinde
  olusan bantlar kesilip, her parçadaki boya ayri
  ayri çözülerek titrasyonla veya spektrofotometrik
  olarak miktarlarinin saptanmasi yoluna
  gidilirken, artik daha çok dogrudan bantlardaki
  boya yogunlugunu saptayan dansitometri sistemleri
  kullanilmaktadir.

14

• Dansitometri temel olarak bir absorbans
  ölçümüdür. Bir dansitometre bir destek
• ortamdaki boyanin absorbansini ölçer. Bir
  dansitometrenin temel bilesenlerini isik
  kaynagi, monokromatör, tüm plagin taranmasi için
  hareketli bir tasiyici, optik sistem ve bir
  fotodetektör olusturur. Fotodetektörle saptanan
  sinyaller örnegin konsantrasyonuyla orantili olan
  destekteki boyanin absorbansiyla iliskilidir.
  Destek ortami sabit bir hizla isik demetinden
  geçirilir, böylece farkli noktalarda alinan çoklu
• dansite okumalarinin sundugu bir grafik
  olusturulabilir.

15

• Modern dansitometrelerin egrinin altinda kalan
  alani bulabilen bilgi-islemcileri vardir,
  böylece, tüm fraksiyonlarin miktari saptanabilir.
  The Beckman Appraise, klinik laboratuvarlarda
  yaygin olarak kullanilan dansitometrelerin bir
  örnegidir. Bu modelin hasta sonuçlarinin rapor
  edilmesi ve yorumlanmasi için ayrintili bir
  veritabani yönetim sistemi vardir.

16
ELEKTROFOREZ TÜRLERI

• 1. Kagit elektroforezi
• 2. Selüloz asetat elektroforezi
• 3. Jel elektroforezi
• a. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)
• b. Agaroz jel elektroforezi
• 4. Kapiller elektroforez
•  

17
Agaroz Jel Elektroforezi
ELEKTROFOREZE BIR ÖRNEK

• Kullanilan malzeme ve ekipmanlar
• Bir elektroforez tanki (chamber) ve güç
  kaynagi
• Jel tablasi(Gel casting trays)
• Elektroforez çözeltisi
• Yüklü çözelti (loading buffer)

18
Agaroz deniz yosunlarindan elde edilen bir
seker molekülü zinciridir. Üreticiler
bilimsel çalismalar için özel toz formlar yapar
ve oldukça da pahalidir.
19
Electrical leads ?
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
Jel hazirlanirken

• Agaroz pudrasi istenilen yogunluktaki
  elektroforez çözeltisi(10X stok çözelti) ile
  karistirilir.
• -Tamamen eriyene kadar firinda (microwave
  oven)isitilir.
• -Genellikle elektroforez sonrasi DNAyi
  görebilmek için son asamada solusyona Etidyum
  bromur (10 mg/ml) eklenir.
• -Solusyonun yaklasik 60Cye kadar sogumasi
  beklenir
• -Katilasmadan evvel içinde örnek taragi bulunan
  jel tablasina dökülür.
• -Oda sicakliginda katilasmasi beklenir,sayet
  aceleyse buzdolabinda da dondurulabil
• -Jel katilastinda,üzerinde olusan çukurluklarin
  parçalanmamasina itina göstererek tarak
  çikarilir.
• -Hala plastik tablasinda bulunan jel yatay
  olarak elektroforez tankina yerlestirilir
• -Islak kalmasi ve elektrigi iletmesi için tank
  tampon çözeltiyle kaplanir

23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
(No Transcript)
26
(No Transcript)
27
-Kullanilacak olan DNA yüklü çözelti ile
karistirilip mikropipetler vasitasiyla jel
çukurlarina yüklenir. -Mikropipetler ile
genellikle 5-10 µl yükleme yapilir. -Güç
vericiler aparata baglanip akim verilir,böylece
bir elektrik alan olusturulur. -DNAlar pozitif
elektroda dogru göç etmeye baslayacaktir.
28
(No Transcript)
29
DNA?
?
?
? wells
buffer ?
Anode? (positive)
?Cathode (negative)
30
-Yüklü çözeltide 2 tane belirleyici boya (the
tracking dyes) oldugundan bahsetmistik. Renkli
boyalarin göçüsünün izlenmesi ile de var olan
DNAnin göçüsü izlenebilir. Bunlar Bromofenol
blue ve xylene cyanol. Bunlar agaroz jelde 300
ile 4000 bplik çift zincirli DNA fragmentleri
ile ayni yönde göçerler. -Blue (leading
dye)oldukça hizli olup jelin sonunda rahatlikla
görülür. -Kirmizi olan ise oldukça
yavastir. -Bizim DNAmiz ise bu iki
belirleyicinin arasinda bir yerde olmasi
beklenir.
31
-Göçün tamamlandigindan emin olundugunda DNA
parçalari etidyum bromid sayesinde izlenebilir.
Çünkü EtBr bir interkalasyon ajanidir DNAnin
içine kendini çok küçük bir çizgi halinde
yerlestirip orda kalir,üstelik de UV isiginin
altinda parlak bi bant halinde görülmeyi
saglar.Ayrica EtBr,DNAya baglanip onun
agirligini ve sertligini degistirdigi gibi onun
hareket kabiliyetini de etkiler.
32
Marker
-Çesitli tiplerde DNA büyüklük belirleyici
markerlar var. -Markerlar kendi DNAmizin
büyüklügünü görebilmek amaçli kullanilan
belirteçlerdir -Jele DNAmizi yüklemeden önce
markerlar yüklenir. -Eskiden en ucuz marker
temin etmenin yolu bakteriyofaj DNAsinin
restriksiyon enzimleri kesilmesiyle elde
etmekti. -Simdi bunlari üretip satan sirketler
var.
33
(No Transcript)
34
Voltaj

• Genellikle v/cm ile ifade edilip buradaki cm
  degeri jel uzunlugu degil, iki elektrot arasi
  uzakliktir.
• -Örnegin elektrotlar arasi uzaklik 10 cm ise
  yürütme için 50Vluk elektrik verilir.
• -Ama genellikle TBE çözeltisi içindeki normal
  büyükteki jel için 30 dakika 100 V luk akim
  uygulanir.

35
-Bir güç kaynaginda voltaji,akimi ve de güç
seviyelerini gösteren 3 bölüm vardir. -
Yürütmenin sonunda güç kaynagi kapatilir.
-Jel tanki karanlik bir odaya alinir ve UV isik
kutusunda incelenir.
36
Cathode (-)
? wells
? Bromophenol Blue
DNA (-) ?
Anode ()
37
Bu fotografta görüldügü gibi band numaralari
çukurlarin üzerine yazilir.Böylece küçük parçalar
fotografin üstündedir çünkü onlar çok hizli
hareket ederler.Burada 4 ve 5.nci çizgiler
standart çizgiler olarak belirlenmis.Bu bantlar
spesifik DNAlar olup kontrol amaçli kullanilan
markerlardir. Büyüklükleri bilinir.Örnegin 5.
çizgideki DNA E.colinin lamda bakteriyofaji ile
kesildi dolayisiyla uzunlugu tahmin
edilebilir.DNA parçalarinin büyüklükleri
arasinda logaritmik bir artis vardir. Standart
çizgiler arasindaki uzakligin ölçülmesiyle, biz
kendi DNAmizin standart egrisini olusturabiliriz.
38
(No Transcript)
39
KULLANIM ALANLARI
Saflastirma Saflik kontrolu Molekül
agirligi saptama Kalitsal veya kalitsal olmayan
hastalik saptama Enzim izozimlerinin saptanmasi
(tanisal amaçli, populasyon çalismasi için, adli
tipta) Immünolojik ve moleküler biyoloji  
40
?