Inducci

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Inducción de proteína recombinante

• Antecedentes y experimento

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Objetivos

• Conocer el fundamento de la inducción de la
  síntesis de proteínas recombinantes en E. coli.
• Realizar la inducción de una proteína
  recombinante (?-lactamasa).
• Obtener la curva temporal de inducción de una
  proteína recombinante.
• Interpretar el patrón electroforético de
  producción de una proteína recombinante.
• Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las
  proteínas recombinantes.

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Tecnología del DNA recombinante, clonación génica
o ingeniería genética
Estudio de una secuencia específica de DNA que
suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de
secuencias. Aislamiento, amplificación,
secuenciación y expresión de un fragmento de DNA
específico
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Propiedad básica del DNA que permite su
manipulación
El acoplamiento de cadenas por
complementariedad. La extraordinaria
especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso
instrumento para la identificación, aislamiento,
clonación de fragmentos de DNA complementarios a
uno dado
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Tecnología de DNA recombinante Aislamiento de un
gen de un organismo para introducirlo en otro
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Características de las proteínas que se pueden
producir en un organismo transgénico

• Compartimento en el que la proteína se expresará
  necesita una secuencia señal?
• Si es un proteína membranal hay que considerar
  que la proteína completa no se pueda expresar
• Si la proteína tiene puentes disulfuro, el
  huésped debe ser capaz de formar los puentes
  disulfuro
• Modificaciones pos-transduccionales. El huésped
  debe ser capaz de hacer las modificaciones
  post-traduccionales
• Complejo proteico, hay que considerar la
  estrategia de co-expresión
• La posible toxicidad de la proteína, utilizar un
  huésped resistente o un sistema libre de células

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Proteínas recombinantes-fusionadas a otra proteína
8
Otras señales que se pueden introducir a una
proteína
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Clonación del DNA

• DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
• Vector de clonación (vehículo)
• Organismo huésped
• (E. coli)
• Selección de vectores

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Vector de recombinación pET-TEM-1

• Un vector de recombinación es la molécula que
  resulta de la unión de un DNA vector con el DNA
  de interés (inserto en nuestro caso la
  ?-lactamasa).
• Un DNA vector es un vector de clonación que
  permite introducir en una célula hospedera un
  fragmento de DNA que se pretende clonar en esta
  célula hospedera el vector se replica y expresa,
  en su caso.

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Vector de clonación pET-24a()
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(No Transcript)
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La resistencia adquirida a los aminoglucósidos se
debe a 3 mecanismos básicos

• Presencia de enzimas que modifican
  aminoglucósidos Es el mecanismo más común y ha
  sido detectado en diferentes bacilos
  gramnegativos, Staphylococcus aureus y
  Enterococcus spp.Se trata de diversas enzimas
  (acetilasas, adenilasas y fosfatasas) que
  modifican grupos sustituyentes de la molécula, lo
  que resulta en un compuesto de baja afinidad por
  el ribosoma bacteriano. Además no ocurre la
  segunda fase de ingreso acelerado de la droga a
  la célula.
• Alteraciones en los sitios de unión. Se debe a
  mutaciones en los genes que codifican los sitios
  de unión a estas drogas. Es un mecanismo poco
  frecuente y ha sido hallado en E. coli y N.
  gonorrhoeae.
• Disminución del ingreso Determinado por
  alteraciones a nivel de la membrana externa para
  el caso de Pseudomonas aeruginosa, que dificultan
  la entrada de la droga a la bacteria.

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Gene que da resistencia a kanamicina

• Aminoglycoside 3'-phosphotransferase (APH). The
  APH subfamily is part of a larger superfamily
  that includes the catalytic domains of other
  kinases, such as the typical serine/threonine/tyro
  sine protein kinases (PKs), RIO kinases,
  actin-fragmin kinase

atgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattc
caacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtc
gggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgc
cagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttac
agatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccg
accatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccac
tgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgat
tcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgc
attcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcg
tctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagt
gattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaag
aaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggt
gatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggtt
gtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgc
catcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacgg
ctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagt
ttcatttgatgctcgatgagtttttct
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Vector de recombinación pET- TEM-1
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f1 Ori o F1phage origin.

• gcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacact
  tgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctc
  gccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctt
  tagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttga
  ttagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggttttt
  cgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttcca
  aactggaacaa
• El ori que se encuentra tanto en E. coli como en
  los plásmidos son para hacer copias de DNA doble
  cadena. Pero el ori del fago o f1 ori hace una
  copia simple del DNA de cualquier secuencia que
  se encuentre colocada cerca en la orientación
  adecuada.
• De hecho la región de la secuencia del fago
  contiene el origen de replicación para la
  síntesis y empaquetamiento del DNA cadena
  sencilla del bacteriofago. Por lo que cuando es
  incorporado en un plásmido, convierte al plásmido
  en una entidad que puede activamente vivir como
  DNA de cadena sencilla o doble.

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• Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una
  zona promotora y otra terminadora de la
  transcripción

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trangene
Secuencia de unión de la proteína represora
Secuencia que codifica para la proteína represora
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Además el vector PET tiene la secuencia del
promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del
transgene
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Operón lac

• El operón lac consta de tres genes estructurales
  (lacZ, lacY, y lacA), que codifican enzimas
  metabólicas implicados en la utilización de la
  lactosa como fuente de carbono.
• Lac I codifica para una proteína represora
• Operador es una secuencia a la que de manera
  específica se puede unir la proteína represora.
• En presencia de una molécula que se una a la
  proteína represora se reprime la expresión de los
  genes

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Además el vector PET tiene la secuencia del
promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del
transgene

• Promotor T7 lugar en donde se une la RNA
  polimerasa
• Si el represor se une no hay transcripción del
  transgene.
• Cuando hay inductor como el IPTG, se forma el
  complejo IPTG-represor y entonces la RNA
  polimerasa transcribe al transgene.
• En presencia de una molécula como lactosa o un
  análogo se forma un complejo con la proteína
  represora y entonces el complejo no se une al
  operador y entonces la RNA polimerasa transcribe
  el gene.

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• El inductor del operón lac que utilizaremos será
  el isopropiltiogalactósido (IPTG).
• El IPTG suele utilizarse como inductor artificial
  del operón lac, ya que es capaz de unirse al
  represor LacI, pero no es un sustrato para la
  ß-galactosidasa y no puede ser metabolizado por
  la bacteria

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Vector con inserto
o
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El experimento

1. Medio saturado
2. Inocular una alícuota en medio nuevo
3. Alcanzar la absorbancia en donde las células se
   encuentren en la fase log
4. Añadir el inductor
5. Tomar alicuotas (curso temporal de indución de
   proteína recombinante
6. Separación y visualización en un gel de
   poliacrilamida-SDS
7. Determinación del tiempo óptimo de inducción