Antgenos Recombinantes

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Antígenos Recombinantes
Bioq. Natalia Saccodossi
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Fuentes naturales de proteínas Bajos
rendimientos Impurezas Técnicas de ADN
recombinante Permiten la síntesis y la expresión
autónoma, en un huesped determinado, de un
híbrido formado por la combinación de moléculas
de ADN de orígenes diferentes
Proteína heteróloga
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• Estrategia para la obtención de una Proteína
  Heteróloga
• Clonado
• Sistema de Expresión
• Estabilidad
• Solubilidad
• Tamaño
• Modificaciones Post-traduccionales
• Aplicaciones
• Antígeno (alta cc, fácil purificación)
• Estudio de la función biológica
• (mantener la actividad)
• Estudios estructurales (solubilidad)

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Aspectos Técnicos 1- Selección del ADN de
interés Dónde buscarlo ? Qué expresamos
? Cuánto necesitamos ? 2- Selección del
vector Expresión en eucariotas
Expresión en procariotas 3- Digestión,
Ligación del vector y del inserto y
transformación 4- Clonado y Expresión de la
proteína Plegamiento de la proteína 5-
Purificación 6- Detección (SDS-PAGE)
Confirmación de identidad (WB/secuencia de ADN)
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1- Selección del ADN de interés Conocida cAD
N PCR (Gene Bank) Desconocida Antigenicid
ad (Ac) (DNA library) Actividad Biológica
(display en fago)
Qué porción del gen vamos a expresar
? Inserto Compatible con el
del vector
Proteína Entre 20- 100 kDa
Tener en cuenta hidrofilicidad/hidrof
obicidad presencia de péptido señal
Secuencia
Tamaño
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2- Selección
del vector A- Expresión en procariotas B-
Expresión en eucariotasCaracterísticas básicas
1- Origen de replicación ( ori ) necesario para
la replicación del vector dentro del organismo
hospedador. 2- Promotor Sitio de unión de RNA
polimerasa 3- Terminador Sitio de terminación
de la transcripción. 4- Sitio de unión a
ribosomas se une la subunidad menor del ribosoma
en el momento de iniciarse la traducción. 5-
Sitio de clonado (polilinker, multiple cloning
site) Región del vector que posee varias
secuencias compatibles con sitios de corte de
enzimas de restricción 6- Factor de selección
Codifica el/los marcador/es de selección que
permita diferenciar células transformadas 7-
Otras características secuencias codificantes
para fusion-tag, His-tag, péptido señal de
localización periplasmatica, etc.
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Esquema básico de un vector de clonado
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pET-22b() región de clonado y expresión
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3- Digestión, Ligación y transformación
Vector Inserto

• Tanto el inserto como el vector se cortan con las
  mismas enzimas de restriccion (2 enzimas
  distintas)
• -Ligan en forma unidireccional

Digestión
Ligación
Transformación
ATG
Cultivo en cepas de clonado
Stock -70 ºC Purificación
Transformación en cepa de expresión

• Transformación / transfección en huesped
  seleccionado.

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4- Clonado y
Expresión A- Las construcciones recombinantes
antes de ser expresadas, se clonan en cepas
bacterianas especiales que son exclusivamente de
clonado (JM109, DH5a) y NO de expresión.
STOCK -70 ºC B- Los plásmidos
recombinantes son purificados de las cepas de
clonado y son transformados en las cepas de
expresión o transfectados en las células de
interés. Existen distintos sistemas de
expresión. C- Los cultivos celulares
transformados o transfectados deben realizarse en
un medio de selección D- El cultivo para que
exprese la proteína de interés debe ser inducido.
Responde a la regulación de un operon (operon
lac). E- Seguimiento de la proteína de
interés SDS-PAGE Western blot
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Operon lac
IPTG
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Sistemas de expresión
Procariotas E. coli Eucariotas inferiores S.
cerevisae P. pastoris superiores cel.
mamíferos plantas cel. de
insecto Tener en cuenta -Capacidad de expresión
del sistema -Modificaciones post-traduccionales -P
legamiento de la proteína -Equipamiento requerido
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Ventajas1-Tiempo de replicación muy bajo (20
min). 2- Alcanza alta densidad en cultivo
utilizando sustratos baratos. 3- Son sistemas
genéticamente bien caracterizados (se conocen
secuencias de represores y promotores)4- Hay una
amplia disponibilidad de plásmidos y cepas
mutantes para una gran variedad de usos.
Procariotas
Desventajas1- Algunas proteínas producidas en
bacterias se tornan inestables o carecen de
actividad biológica (no hay modificaciones
post-traduccionales).2- Presencia de pirógenos
en proteínas de uso terapéutico. 3-Formación de
cuerpos de inclusión
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Cuerpos de Inclusión
Agregados insolubles de proteínas inactivas que
se forman como consecuencia de la sobre-expresión
de proteínas recombinantes.
Favorece su formación 1- Aumento de la velocidad
de expresión. 2- Disminución de la velocidad de
plegado. 3- Aumento de la velocidad de agregación
Ventajas permiten en una forma fácil enriquecer
la muestra en la proteína deseada y además la
protegen de la acción de proteasas citoplasmáticas
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Plegamiento de la proteína soluble citosol
periplasma peptido señal cuerpos de
inclusión Solubilizar con caotrópicos Plegam
iento in vitro dilución o diálisis concentraci
ón de proteínas 10-50 ?g/ml cupla redox
GSH-GSSG Aditivos de bajo PM grupos
prostéticos metales urea,
Cl-Gdn Arg/Hcl
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Plegamiento in vitro
Por dilución
Por diálisis
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Eucariotas
Surgen debido a la necesidad de solucionar los
problemas que presentan los sistemas procariotas
(solubilidad, modificaciones post-traduccionales)
Existen distintos sistemas 1. Levaduras 2.
Células de insecto 3. Células de mamífero 4.
Sistemas libres de células Lisado de
reticulocitos de conejo, germen de trigo, etc.

• Caracteristicas generales
• Realizan algunas modificaciones
  post-traduccionales a las proteínas heterólogas
  (no hay sistema de expresión in Vitro que sea
  capaz de realizar todas las posibles
  modificaciones).
• Los vectores tienen las mismas características
  que los de bacterias (ori, resistencia a ATB,
  promotores, etc.)
• Hay vectores que comparten características de
  vectores procariotas (shuttles vectors). Permiten
  clonar el plasmido en bacterias.

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1-Levaduras Microorganismos
Eucariotes 1- Manipuleo similar a E. Coli 2-
Entorno Biológico que facilita el folding de
proteínas 3- Garantiza proteínas
secretadas
El huésped mas utilizado es el Saccharomyces
cerevisiae 1- Es bien conocida su fisiología y
genética. 2- Se conocen promotores fuertes. 3-
S.cerevisiae es capaz de realizar muchas
modificaciones post-traduccionales. 4- Es un
organismo seguro (FDA generally recognized as
safe).
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Ventajas 1. Solubiliza proteínas insolubles en
E. Coli 2. Evita degradación de la proteína
heteróloga 3. Puede fosforilar y glucosilar
proteínas Desventajas 1. Técnica de
transformación más compleja que bacterias
(remoción de Ez, utilización sales de Li,
electroporación) 2. Hiperglicosilación de
proteínas heterólogas. 3. Algunas proteínas
diseñadas para ser exportadas son retenidas en
citoplasma. 4. Durante scale-up se pierde el
plásmido.
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2- Células de insecto Cuando las
modificaciones post-traduccionales son
críticas Sistema Células de insecto infectadas
con baculovirus AcMNPV Autographa
california multiple nuclear polyhedrosis
virus Estrategia Usa AcMNPV con el polihedryn
gene sustituido por el de la proteína
heteróloga. Ventajas Scale-up en
fermentadores Puede expresar 2 o más genes en
simultáneo
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(No Transcript)
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3- Células de mamíferos
Característica de los vectores usados 1. Sitio
enhancer/promotor (CMV), terminador y secuencia
de poli-adenilacion. 2. Origen de replicación
(SV40). 3. Marcadores de selección (resistencia a
G-418). 4. Enhancers (intron entre promotor y gen
heterólogo). 5. MCS (secuencia múltiple de
clonado). 6. Secuencias que permitan clonado en
bacterias (shuttles vectors)
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pCi-neo
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Proteína heteróloga Sistema de expresión
Niveles de producción Altos Bajos
Bacterias Células de Levaduras Células de
(50 ?g/ml) insectos mamíferos
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5- Detección
Control de calidad de proteínas
recombinantes Geles de poliacrilamida isoelec
troenfoque exclusion molecular cromatografía de
afinidad espectroscopía dicroismo
circular Secuencia aminoacídica Ensayos
inmunológicos y biológicos
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Existen algunos problemas.. -falta de
solubilidad -no tenemos como detectar
específicamente la proteína recombinante -difícil
de purificar
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Proteínas y peptidos de fusión Proteínas de
fusión GST MBP Estreptoavidina Tiorred
oxina GFP (green fluorescence
protein) Peptidos de fusión Histidina
(6Hys) Streptag (9Aa) c-Myc HA
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GST-Tag( Glutation S-transferasa )
Utilidades 1. Permiten la purificación por
cromatografía de afinidad utilizando glutation
reducido inmovilizado en una matriz 2. Muchas
proteínas de fusión con GST-Tag permanecen en
forma soluble y estable aun a altos niveles de
expresión.
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(No Transcript)
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SDS-PAGE A partir de un lisado bacteriano
GST-mioglobina purificada
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His-Tag( colas de polihistidina )
Cola formada por 6 His que permite su utilización
para purificar por cromatografía de afinidad
usando metales inmovilizados sobre una matriz
(IMAC immobilized metal affinity chromatography)
IDA NTA
Ni 2
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Purificación de Proteínas con His-Tag
La estrategia dependerá de la forma en que se
produzca la proteína Soluble purificación bajo
condiciones nativas. (sin DTT, sin agentes
caotropicos) por lo general se eluye con imidazol
y se trabaja con un buffer fisiológico
PBS Insoluble purificación bajo condiciones
desnaturalizantes ( DTT, urea), se puede eluir la
proteína por variación del pH o utilizando
imidazol
Es una ventaja de esta estrategia poder purificar
la proteína en condiciones desnaturalizadas!!!!
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Problemas con His-Tag

• Oclusión de la cola de histidina durante el
  plegado de la proteína (solución cambiar
  ubicación Nt o Ct )
• Interferencia de la cola con la actividad de la
  proteína (insertar un sitio proteolítico antes de
  la cola para su posterior digestión)

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Clivaje proteolítico de proteínas de fusión
Cuando? Cuando se observan diferencias de
antigenicidad, actividad enzimática,
características de binding, etc, entre las
proteínas nativas y las de fusión Como? Se
agrega una secuencia que es reconocida por una
proteasa entre la proteína y la GST-Tag. Enzimas
más utilizadas Trombina, Factor Xa, enteroquinasa
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Epitope Tagging Epitope de secuencia
conocida, para el cual se disponen de Ac
específicos, que permiten estudiar el tráfico
intracelular, la interacción proteína-proteína y
la purificación de la proteína de interés
Debe ejercer mínimos efectos sobre la estructura
y la función de la proteína Altamente
específico y con mímima cross- reactividad Epitop
es más utilizados HA (Wilson et al, 1984) Myc
(Evan et al, 1985) FLAG (Hopp et al,
1988) 5-GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAC AAG-3
asp tyr lys asp asp asp
asp lys
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Consideraciones para el diseño de un Epitope
Tagging A- Criterios de Elección Disponibilida
d de AcMo anti-Tag B- Localización del
Tag C o N terminal C- Inmunoprecipitación anti
-Tag-sepharose D- Detección Westernblot
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1- Selección del ADN de interés Conocida cAD
N PCR (Gene Bank) Desconocida Antigenicid
ad (Ac) (DNA library) Actividad Biológica
(display en fago)
Qué porción del gen vamos a expresar
? Inserto Compatible con el
del vector
Proteína Entre 20- 100 kDa
Tener en cuenta hidrofilicidad/hidrof
obicidad presencia de péptido señal
Secuencia
Tamaño
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Display en fago ?Permite evaluar bibliotecas con
un alto número de clones. ?Involucra la
expresión de proteínas en la superficie del
fago ?Puedo usar bibliotecas construidas con
genes humanos
?La secuencia de ADN de la proteína se introduce
en un fagémido y se expresa fusionada a g3p, una
proteína de la nucleocápside.
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? Estrategia
-Se aisla RNA total a partir de células de
interés -Se purifica el RNAm por cromatografía de
afinidad con oligo(dT)-celulosa -Se hace una
RT-PCR y se obtiene el ADNc de la secuencia de
interés con primers específicos -Se amplifica por
PCR usando set de primers con sitios de
restricción para ser clonado en el vector
fagémido.
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-Se liga la construcción de la secuencia de
interés con el fagémido y se introduce en E.
coli. El DNAdc entra a la bacteria. -Las
bacterias que contienen el fagémido se infectan
con el fago helper que contiene la información
para la síntesis de proteínas estructurales del
fago.
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? Selección con el Antígeno Inmovilizado
-Se liberan fagos que expresan la proteína
recombinante en la nucleocápside al medio de
cultivo. -Se enfrentan con una proteína o péptido
inmovilizado -Los fagos que no se unen son
removidos con lavados -Con elución astringente
salen los fagos que expresan proteínas que
interaccionan con más afinidad con la proteína o
péptido fijado.
-Se incuban con las bacterias, pero esta vez sin
los fagos helper, para que la proteína sea
secretada al medio. Cepas de E.coli no supresoras
codon stop AMBER -Luego la proteína puede ser
purificada utilizando estrategias de péptidos o
proteínas de fusión .
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? Ventajas Display en fago -A partir de
bibliotecas de orígenes diversos podemos obtener
la secuencia de la proteína de interés -Permite
el aislamiento de la proteína de interés por su
interacción con la proteína fijada. -Permite
obtener el cDNA de una proteína desconocida a
través de la interacción con una proteína o
varias proteínas. -Se puede producir la proteína
seleccionada en forma rápida y económica -Se
relaciona el fenotipo del fago con el genotipo,
esto permite la selección y amplificación del gen
de interés de pooles de miles de clones (a partir
de una biblioteca).
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Bibliografía de referencia
Proteínas recombinantes -Molecular cloning, a
laboratory manual. Sambrook and Russell. Third
edition. -The production of antibody fragments
and antibody fusion proteins by yeast and
filamentous fungi. Vivi Joosten, Christien
Lokman, Cees AMJJ van den Hondel and Peter J
Punt. Microbial cell factories (2003)
1-15. Display en fago -Phage display technology
clinical applications and recent innovations.
Hassan M.E. Azzazi, W. Edward Highsmith, Jr.
Clinical Biochemistry 35 (2002) 425-445.