Estudos de express

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Estudos de expressão gênica análise e
quantificação de RNA Northern blot RT-PCR e
Real Time RT-PCR Técnicas de estudo da regulação
da expressão gênica DNA footprinting Band
shift Transfecção com gene reporter Duplo-hí
brido CHIP (chromatin immunoprecipitation Técn
icas de estudo de expressão gênica em escala
genômica DNA Microarray Análise de EST
(expressed sequence tags) SAGE (serial
analysis of gene expression)
2
Etapas na expressão de genes nas células
3
(No Transcript)
4
Filme raio X ou Phosphoimager
5
In Situ Hybridization
In situ hybridization of a Drosophila embryo with
probes for even-skipped (red) and hunchback
(green).
6
Run on
7
Northern blot e nuclear run on indicam
regulação pós-transcricional
Amastin
Tuzin
8
Determinação da vida média de mRNAs de amastina
em amastigotas 74 min em epimastigotas 11 min
Tratamento com ActD Extração de RNA
Northern blot
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Quantificação da expressão de um mRNA

• Northern blot
• Proteção à RNAse
• Primer extension
• RT-PCR (?)
• Real Time PCR

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RT-PCR
11
Determinação do limiar de detecção Ct
12
O valor de Ct é correlacionado com a quantidade
inicial de DNA amplificado
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Quantificação de RNA por Real-Time PCR
Detecção de fluorescência gerada em cada ciclo
de amplificação - SYBR green - Primers
fluorescentes
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Quantificação de RNA por Real-Time PCRo método
TaqMan
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Estudo de promotores transfecção c/ gene repórter

• Genes repórteres
• CAT
• Luciferase
• b-gal

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Estudo de promotores a técnica de DNA
footprinting
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Estudo de promotores a técnica de
band-shiftEletrophoretic Mobility Shift Assay
EMSA
DNA proteína gel não desnaturante
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Estudos de expressão de mRNA em escala genômica
High throughput analysis

• Microarrays
• cDNAs
• Oligos
• Gene chips (Affymetrix)
• ESTs
• SAGE

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Estudos de expressão de mRNA em escala genômica
DNA Microarray
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Análises de EST

• Single-pass sequencing of random cDNAs
• Somente sequencias do 5 ou 3
• Sequências de baixa qualidade
• ESTs são cDNAs
• Representam mRNAs
• Correspondem a regiões transcritas do genoma
• Uso de bibliotecas normalizadas e
  não-normalizadas

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SAGE Serial Analysis of Gene Expression
Schematic illustration of the SAGE process. (A)
Poly(A )RNA is extracted and transcribed into
double-stranded cDNA, primed by biotinylated
oligo (dT) (black circles), and digested with the
Anchoring Enzyme. (B) The 3-most fragments are
isolated by binding them to streptavidin beads
(gray ellipses). (C) The fragments are divided
and ligated to different linkers (L1, L2). (D)
The isolated linker-tags are blunt-ended. (E) The
linker-tags are ligated to linker-ditag-linker
constructs and amplified by PCR (E). (F) The
ditags are isolated, ligated to concatamers,
cloned, and sequenced.
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CHIP Imunoprecipitação da cromatina
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Duplo-híbrido em levedura
GENE REPORTER
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Duplo-híbrido em levedura
- Detecção de colônias azuis - Crescimento em
meio sem his
Co-transformação de leveduras his-
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(No Transcript)
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Yeast genome/proteome database 12Mb 6000
genes (50 with assigned function)
10 involved in transcription 141 with their
activity tested myc-tagging
Anti-Myc
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CHIP e Microarray podem identificar todos os
genes regulados por um mesmo fator de
transcrição
6361 spots, representing all of the known
intergenic regions in the yeast genome. (average
size 480 bp)
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Identificação de sequencias regulatóriasreconhec
idas por uma RBP
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Estudo da regulação da tradução
Uso de Microarray para identificação de genes
associados a polissomos